El polvo de hoja de neem (Azadirachta indica) mitiga el estrés oxidativo y las alteraciones patológicas provocadas por la toxicidad del plomo en la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 9170 (2023) Citar este artículo

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Este estudio investigó los síntomas clínicos y patológicos de la toxicidad por plomo transmitida por el agua en tilapia silvestre del Nilo recolectada en un área contaminada con plomo (el Canal Mariotteya: Pb = 0,6 ± 0,21 mg L-1) y en un pez de piscifactoría después de 2 semanas de exposición experimental al plomo. acetato (5–10 mg L-1) además de evaluar la eficacia del tratamiento con polvo de hoja de neem (NLP) para mitigar los síntomas de la toxicidad del plomo. Un total de 150 peces (20 ± 2 g) se separaron en cinco grupos (30 peces/grupo con tres repeticiones). G1 se asignó como control negativo sin ningún tratamiento. Los grupos (2 a 5) fueron expuestos a acetato de plomo durante 2 semanas a una concentración de 5 mg L-1 (G2 y G3) o 10 mg L-1 (G4 y G5). Durante el período de exposición al plomo, todos los grupos se criaron en las mismas condiciones, mientras que G3 y G5 fueron tratados con 1 g L-1 de PNL. La toxicidad del plomo indujo la fragmentación del ADN y la peroxidación lipídica y disminuyó el nivel de glutatión y la expresión de la enzima de síntesis del hemo ácido delta aminolevulínico deshidratasa (ALA-D) en tilapia silvestre, G2 y G4. La PNL pudo aliviar el estrés oxidativo estimulado por el plomo en G3 y mostró un efecto insignificante en G5. Los hallazgos patológicos, incluida la hiperplasia epitelial en las branquias, el edema en las branquias y los músculos, la degeneración y necrosis en el hígado y los músculos, y la infiltración leucocitaria en todos los órganos, se correlacionaron directamente con la concentración de plomo. Así, la aplicación acuosa de PNL a 1 g L-1 redujo el estrés oxidativo y disminuyó las alteraciones patológicas inducidas por la toxicidad del plomo.

Se cree que la acuicultura es una forma práctica de reemplazar y conservar poblaciones sobreexplotadas y especies de peces en peligro de extinción, así como de cerrar la brecha entre la producción y la demanda humana1,2,3. La acuicultura ha aumentado significativamente la cantidad de productos del mar producidos desde la década de 1970, pero todavía existen varios desafíos para la industria. Una variedad de factores interrelacionados, como el medio ambiente acuático, la nutrición y el ganado cultivado, influyen en la eficacia con que operan las operaciones acuícolas. La acuicultura sostenible se basa en maximizar estas variables4. El empleo de técnicas sostenibles y respetuosas con el medio ambiente para impulsar la eficacia de la acuicultura y mitigar los factores de estrés ambiental se ha vuelto de interés recientemente5.

Durante un período muy largo, los mejores métodos para aumentar el crecimiento, el desarrollo, la inmunidad y tratar infecciones fueron la quimioterapia y los antibióticos. Sin embargo, el uso continuado de la quimioterapia convencional en la acuicultura se vio limitado por una serie de consecuencias negativas sobre la inmunidad natural y la ecología de los peces6,7. Se han puesto a disposición del sector acuícola enfoques ecológicos como alternativa8,9,10,11. Las enzimas exógenas, los microorganismos benéficos y las plantas medicinales son las tácticas ideales para la salud y la producción de los organismos acuáticos12,13,14,15. El medio acuático es un sumidero de muchos contaminantes ambientales16,17,18. El plomo es un elemento no fundamental que ingresa al ecosistema acuático procedente de diversas fuentes, como procesos mineros e industriales19,20. El plomo es un metal inactivo redox que puede acumularse en los tejidos y órganos de los organismos acuáticos y puede persistir en el agua y los sedimentos durante mucho tiempo21,22,23. El estrés oxidativo es el mecanismo central de la toxicidad estimulada por el plomo. El aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) más allá de la capacidad del sistema antioxidante origina peroxidación lipídica en las membranas celulares de varios órganos, oxidación de proteínas y ADN, desactivación de enzimas, alteraciones en la expresión genética y alteraciones en el estado redox celular24,25. Las estructuras del sistema antioxidante del pescado comprenden enzimas y antioxidantes de bajo peso molecular26. La superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión-s-transferasa (GST) son las principales enzimas antioxidantes y sirven como marcadores cruciales del estrés oxidativo2,4,27. Además, las reducciones de glutatión (GSH) y disulfuro de glutatión oxidado (GSSG) desempeñan una función crucial en la defensa antioxidante no enzimática28. El plomo modifica el sistema hematopoyético al inhibir la síntesis de hemoglobina y restringir enzimas esenciales en la vía de síntesis del hemo. También reduce la vida útil de los eritrocitos circulantes al aumentar la fragilidad de las membranas celulares29. El plomo regula a la baja tres enzimas clave necesarias para sintetizar el hemo, la más destacada de las cuales es la deshidratasa del ácido delta aminolevulínico (ALA-D), también identificada como porfobilinógeno sintasa. ALA-D es una enzima citosólica que cataliza la segunda fase de la síntesis del hemo formando porfobilinógeno a partir del ácido delta-aminolevulínico (ALA)30,31. Aunque ALA-D se expresa en todos los tejidos, los eritrocitos y el hígado tienen los niveles de expresión más altos32,33. La regulación negativa o inactivación de la enzima ALA-D se emplea clínicamente para medir el nivel de toxicidad del plomo29,34,35. La contaminación del agua produce diversos cambios patológicos en el tejido de los peces, cuya gravedad puede asociarse con el grado de contaminación del agua36,37. Los dos órganos más afectados son las branquias, que entran en contacto directo con los contaminantes del agua, y el hígado, que participa en la desintoxicación. La bioacumulación de metales pesados también puede afectar a otros órganos38,39,40.

La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) es el pez de agua dulce cultivado más consumido en Egipto10,40,41. El Canal Mariotteya es un cuerpo de agua contaminado con metales pesados42. La tilapia cultivada en este sitio contaminado se considera un bioindicador adecuado de contaminación por metales y presenta un riesgo potencial para el bienestar humano21,22,23. Es importante lograr una reducción eficaz del plomo al menos por debajo del nivel reglamentario en las aguas residuales domésticas e industriales. La adsorción de metales pesados por materiales agrícolas ha sido ampliamente explorada43. Neem (Azadirachta indica) es una planta terapéutica prometedora que controla los peces depredadores y trata muchas enfermedades bacterianas y parasitarias de los peces. Tiene capacidad adsorbente de diversos metales como plomo y cadmio44,45,46. Las materias primas vegetales (hojas) se cosechan y se aplican inmediatamente o después de secarlas y triturarlas. Una forma sencilla de preparar extracto acuoso de neem es remojar material vegetal en agua. El polvo de hoja de neem crudo (PNL) y su extracto acuoso presentan más beneficios para los animales y los peces que efectos nocivos47. Bhattacharyya y Sharma44 encontraron que 1,2 g L-1 de PNL podrían eliminar hasta el 93% del plomo en 96 h de una solución de 300 mg L-1 utilizando tecnología de adsorción por lotes.

Este estudio exploró la influencia del plomo en el estado de salud de los peces mediante la estimación de la bioacumulación de plomo en varios tejidos y la evaluación del estrés oxidativo en el hígado, branquias y músculos de O. niloticus, que refleja la contaminación por metales del ambiente acuático. También realizamos una evaluación histopatológica de órganos de peces recolectados de un sitio contaminado naturalmente y con toxicidad experimental inducida por plomo, refiriéndose explícitamente al papel potencial de la exposición acuosa del polvo de hoja de neem en la reducción de la toxicidad del plomo.

Se recolectaron muestras de agua superficial y tilapia silvestre del Nilo del Canal Mariotteya en Giza, Egipto, que sufre graves problemas de contaminación biológica y química debido a una entrada masiva de desechos domésticos, agrícolas e industriales sin tratar42. Se recogieron tres muestras de agua en botellas de vidrio limpias (volumen de 1 litro) a 30 cm por debajo de la superficie del agua. Se recolectaron un total de diez tilapias silvestres del Nilo con un peso corporal promedio de 200 ± 30 g de la misma área y se transportaron en una caja de hielo al laboratorio. Se diseccionaron peces para obtener muestras de hígado, branquias y músculos. El análisis de la concentración de plomo se realizó en el agua y en parte de las muestras de tejido el día del muestreo. Partes de los tejidos se mantuvieron a -80 °C para evaluar biomarcadores oxidantes/antioxidantes, genotoxicidad y expresión genética; otro se utilizó para la evaluación histopatológica.

Las muestras de agua se mezclaron con ácido nítrico, se purificaron a través de un filtro de vidrio y se analizaron utilizando un espectrofotómetro atómico (Modelo 3100, Perkin-Elma, Norwalk, CT, EE. UU.). Las muestras de tejido se deshidrataron a 105 °C durante 12 h, se quemaron a 550 °C durante 16 h en un horno de mufla, se digirieron con ácido (HNO3) y se diluyeron con agua desionizada hasta un volumen establecido utilizando el procedimiento de ceniza seca recomendado por Omar. et al.48. La concentración de plomo en los tejidos de los peces se expresó en mg kg-1.

Las hojas maduras de A. indica se recolectaron del Centro de Investigación Agrícola, Egipto. Las hojas se lavaron minuciosamente para eliminar polvo e impurezas y luego se secaron a temperatura ambiente y en estufa a 50 °C durante 3 días. Las hojas secas se trituraron y tamizaron para recoger el polvo fino de hojas de neem (NLP). El polvo se lavó con agua purificada para eliminar el pigmento y la turbidez, se volvió a secar y se almacenó en un frasco de vidrio como biosorbente46. La PNL se analizó utilizando una columna capilar directa TG-5MS y un espectrómetro de masas GC-TSQ (Thermo Fisher Scientific, Austin, TX, EE. UU.), y se determinó la composición química del extracto etanólico de neem. La temperatura del horno de columna se mantuvo inicialmente a 60 °C, se expandió a 250 °C a 6 °C min-1, se mantuvo durante 1 min y luego se elevó a 300 °C a 30 °C min-1. La temperatura del inyector se mantuvo a 270 °C. Se utilizó helio puro como gas portador a un caudal constante de 1 ml min-1. Utilizando un Autosampler AS3000 y GC en modo dividido, se inyectaron automáticamente muestras diluidas de 1 µl con un retraso de disolvente de 4 minutos. En el modo de exploración completa, se recopilaron espectros de masas EI que cubrían el rango m/z de 50 a 650 a voltajes de ionización de 70 eV.

Se compraron un total de 150 O. niloticus machos monosexuales, con un peso de 20 ± 2 g y una edad de 2 meses, en una piscifactoría privada en la gobernación de Sharkia, Egipto. Se distribuyeron en 15 acuarios de vidrio (40 × 30 × 100 cm) con un volumen total de 60 L de agua. Dos semanas después de la aclimatación, los peces se distribuyeron en cinco grupos (30 peces/grupo con tres repeticiones). G1 se asignó como control negativo sin ningún tratamiento. Los grupos (2 a 5) fueron expuestos a acetato de plomo disuelto en agua de cría durante dos semanas a una concentración de 5 mg L-1 (G2 y G3) o 10 mg L-1 (G4 y G5)49. Durante el período de exposición al plomo, todos los grupos se criaron en las mismas condiciones, mientras que G3 y G5 fueron tratados con 1 g L-1 de NLP44 (Fig. 1). Al final de la prueba, se sacrificaron cinco peces por acuario con Ictyoclove® (Francia) para la recolección de tejido (hígado, branquias y músculos).

Esquema del experimento.

La peroxidación lipídica se midió determinando la cantidad de malondialdehído (MDA) (proteína mM g-1) utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)50. La reducción de glutatión (GSH) (proteína g-1 mM) se evaluó según Ellman51. La absorbancia de los colores producidos se midió utilizando un espectrofotómetro UNICO-UV-2100.

La fragmentación del ADN fue detectada por difenilamina. El color azul formado se cuantificó a 578 nm utilizando un espectrofotómetro UNICO-UV-2100. El porcentaje de fragmentación del ADN se expresó como % de fragmentación del ADN = (OD sobrenadante/O. D sobrenadante + OD pellet) × 10052.

Se recogieron muestras de tejido del hígado, branquias y músculos en una solución de triazol para medir la expresión genética. El ARN total se extrajo utilizando un mini kit QIAmp RNA (Qiagen, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración y pureza de las muestras de ARN total se comprobaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000. Para cada muestra, se produjo ADNc utilizando un kit de reactivos PrimeScript RT (Takara, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó una PCR basada en SYBR Green en un ciclador térmico automatizado (Bio-Rad) en un volumen de 25 µl que comprende 2 µl de solución de ADNc, 12,5 µl de SYBR Premix Ex Taq (Takara), 1 µl de cebador (10 µmol L-1). (Tabla 1) y 8,5 µL de ddH2O. La reacción cíclica se completó según las recomendaciones del fabricante mediante PCR estándar de dos pasos. Los valores experimentales de Ct se normalizaron para GAPDH como gen de mantenimiento y se calculó la expresión relativa del ARNm en comparación con una muestra de control. Cada ensayo incluyó muestras por triplicado para cada ADNc analizado y control negativo sin plantilla; la expresión relativa al control se evaluó utilizando el método 2-ΔΔCT53.

Se recogieron muestras de tejido de branquias, hígado, riñones, bazo, cerebro y músculos de peces salvajes y de hígado, branquias y músculos de peces experimentales y se fijaron en tampón de formalina neutra al 10%. Luego, las muestras fijadas se trataron utilizando la práctica de inclusión en parafina, se seccionaron utilizando un microtomo Leica 2135, Alemania, en secciones de 3 a 4 µm de espesor y se tiñeron con tinción H&E. Se realizó un sistema de puntuación semicuantitativo de lesiones en peces experimentales. Una puntuación de 0 indicó ausencia de lesiones, 1 indicó lesiones leves (1-25% del tejido afectado), 2 indicó lesiones moderadas (25-50% del tejido afectado) y 3 demostraron lesiones graves (51%-100% del tejido afectado). tejido afectado).

La evaluación estadística se completó mediante ANOVA unidireccional en SPSS versión 21. Las puntuaciones de las lesiones microscópicas se analizaron estadísticamente mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba U de Mann-Whitney. Las puntuaciones de las lesiones se presentan en un diagrama de caja. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (Vet CU 01122022596—Fecha de aprobación: 12/01/2022) y el comité de ética de la facultad de agricultura de la Universidad de Tanta aprobaron el protocolo experimental y todos los métodos del presente estudio para tratar animales para fines científicos (Aprobación No. AY2019-2020/Sesión 6/2020.01.13). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Nuestros informes de investigaciones con animales siguen las recomendaciones de las pautas de ARRIVE. Los materiales vegetales utilizados en este estudio fueron recolectados, examinados e identificados botánicamente en la Facultad de Agricultura del Desierto de la Universidad Internacional Rey Salman, Egipto, siguiendo las directrices institucionales y la legislación (Número de muestra de vale: Neem/DA-1/2023).

El agua recolectada del Canal Mariotteya estaba contaminada con un alto nivel de plomo (Tabla 2). El nivel medio de plomo fue de 0,6 ± 0,21 mg L-1 (P ˂ 0,01), que es mucho más alto que el límite permisible (0,05 ppm). Las tasas de bioacumulación de plomo fueron significativamente elevadas en el hígado, branquias y músculos de O. niloticus del Canal Mariotteya.

La concentración de peroxidación lipídica en todos los tejidos de G2 aumentó sustancialmente en comparación con el grupo de control, mientras que en G3 disminuyó significativamente hasta acercarse a los valores de control. Además, todos los tejidos de la tilapia silvestre demostraron una concentración significativamente elevada de MDA en comparación con el control experimental y el G2, excepto las branquias, donde las concentraciones de plomo fueron estadísticamente insignificantes. La exposición a 1 g L-1 de PNL no mitigó los efectos peligrosos de la alta concentración de acetato de plomo en G5 (Fig. 2).

Concentración de MDA (mM de proteína g-1) en tejidos de tilapia experimental y salvaje. Las barras con superíndices únicos difieren en (P <0,05).

El nivel de GSH en el tejido hepático del G3 aumentó significativamente en comparación con el G2, sin alteraciones significativas en otros tejidos del mismo grupo. Sin embargo, el contenido de GSH en todos los tejidos salvajes fue sustancialmente mayor que el de nuestros grupos de tratamiento (G2, G3, G4 y G5) y menor que el del control (G1) (Fig. 3).

Reducción de la concentración de glutatión (mM de proteína g-1) en tejidos de tilapia experimental y salvaje. Las barras con letras diferentes se alteran en (P <0,05).

El porcentaje de fragmentación del ADN en todos los tejidos de G2 aumentó significativamente en comparación con el grupo de control, pero disminuyó significativamente en el hígado, las branquias y los músculos de G3 en comparación con G2. La adición de 1 g L-1 de PNL no redujo el efecto genotóxico de 10 mg L-1 de acetato de plomo en G5. Mientras tanto, el porcentaje de fragmentación del ADN en todos los tejidos de tilapia silvestre fue significativamente mayor que en el control (Fig. 4).

% de fragmentación del ADN en tejidos de tilapia del Nilo experimental y salvaje. Las barras mostraron diferentes superíndices alterados en (P <0,05).

El gen ALAD se sobreexpresó significativamente en G3: 3, 2 y 1,8 veces en el hígado, las branquias y el músculo, respectivamente, en comparación con otros grupos de tratamiento. La expresión del gen ALAD se reguló negativamente en todas las muestras de tejido de G2, G4, G5 y tilapia silvestre en comparación con el control (Fig. 5).

RT-PCR cuantitativa de la expresión del gen ALA-D de varios grupos y tilapia silvestre. (a) Evaluación de la expresión del gen ALA-D en el hígado, branquias y órganos musculares en varios grupos y tilapia silvestre en comparación con el control. Los valores se expresan como medias ± SE; n = 5. Las barras que llevan * son diferentes en P < 0,05. (b) Gel recortado de movilidad electroforética de productos de RT-PCR cuantitativa de genes ALA-D y GAPDH (control interno) en gel de agarosa al 2%. Carril 1 = G1; Carril 2 = G3; Carril 3 = G2; Carril 4 = G5; Carril 5 = G4; Carril 6 = tilapia salvaje.

Las muestras de peces del Canal Mariotteya mostraron lesiones variables en diferentes órganos. La microscopía de las branquias reveló aneurismas en las puntas de las laminillas branquiales secundarias, hipertrofia epitelial severa e infiltración leucocitaria masiva en las laminillas branquiales primarias (Fig. 6a), además de áreas de hiperplasia severa de células epiteliales y mucosas, con una fusión de las laminillas branquiales secundarias. (Figura 6b). Se observaron infestaciones parasitarias en las branquias, incluidas metacercarias enquistadas de tamaño variable encerradas en cápsulas de tejido conectivo fibroso y rodeadas por células granulares eosinófilas (EGC) y células mononucleares en el cartílago branquial. El cartílago branquial estaba distorsionado, necrosado y fragmentado (Fig. 6c). Con poca frecuencia se observó epiteliocistis solitaria, una agregación de bacterias en el epitelio branquial (Fig. 6d). La microscopía de los músculos mostró diferentes infestaciones parasitarias identificadas en función de su aspecto morfológico. Hubo metacercaria enquistada acompañada de reacción tisular mínima y quistes parásitos dentro de los haces musculares (Myxobolus spp.) junto con atrofia y degeneración de los haces musculares (Fig. 6e). Además, se observaron múltiples parásitos redondeados de color púrpura de tamaño variable entre las fibras musculares (Ichthyphonus spp.) (Fig. 6f). La microscopía hepática mostró infiltración de EGC en el área del portal, además de células necróticas solitarias, que presentaban cariopicnosis (Fig. 6g). La EGC fue notable en la cápsula del hepatopáncreas, junto con la infiltración de algunos melanomacrofagos en el hepatopáncreas. La microscopía cerebral reveló manguitos linfocíticos perivasculares y áreas de gliosis difusa y focal (Fig. 6h). También mostró degeneración neuronal y meningitis con infiltración leucocitaria. La microscopía renal reveló hinchazón del epitelio tubular con estrechamiento de la luz y células necróticas que mostraban cariopicnosis (Fig. 6i). También se observaron múltiples granulomas con tejido necrótico rodeado de melanomacrofagos, células mononucleares y cápsulas fibrosas (Fig. 6j). Se observaron metacercarias enquistadas rodeadas de cápsulas fibrosas y EGC (Fig. 6k). Respecto al bazo, hubo activación de los centros de melanomacrofagos (Fig. 6l).

(a – d) Branquias, Oreochromis niloticus. (a) Presencia de aneurisma en los vasos sanguíneos laminares en las puntas de las laminillas branquiales secundarias, hiperplasia epitelial, infiltración de células inflamatorias y degeneración cartilaginosa. (b) Hiperplasia grave de células epiteliales y mucosas, fusión de laminillas branquiales secundarias e infiltración de células inflamatorias. (c) Presencia de metacercaria enquistada en el cartílago de las laminillas branquiales primarias. (d) Presencia de epiteliocistis además de infiltración celular inflamatoria grave, incluidas células granulares mononucleares y eosinófilas. (e,f) Músculo. (e) Presencia de quiste parásito dentro de los haces musculares (Myxobolus spp.) junto con atrofia y degeneración de los haces musculares. (f) Presencia de múltiples parásitos redondeados de tamaño variable entre las fibras musculares (Ichthyphonus spp.) (tinción H&E, ×400). (g) Hígado y (h) cerebro de Oreochromis niloticus. (g) Infiltración de células granulares eosinófilas en el área portal y necrosis de hepatocitos solitarios con cariopicnosis (tinción H&E, ×400). (h) Manguitos linfocíticos perivasculares y gliosis extensa (tinción H&E, ×200). (i – k) Riñón y (l) bazo de Oreochromis niloticus. (i) Hinchazón del epitelio tubular renal y estrechamiento de la luz. (j) Granuloma rodeado de tejido fibroso delicado y melanomacrofagos. (k) Metacercaria subcapsular enquistada rodeada de células granulares eosinófilas (tinción H&E, ×400). (l) Activación de los centros de melanomacrofagos en el bazo (tinción H&E, ×200).

En el estudio experimental, la exposición al plomo causó lesiones histopatológicas en las branquias, el hígado y los músculos de los peces, y su gravedad se intensificó con el aumento de la concentración de plomo. La microscopía de branquias en el grupo de control reveló estructuras histológicas normales (Fig. 7a), mientras que en G2 mostró hipertrofia epitelial, levantamiento epitelial, infiltración de leucocitos y edema en las laminillas branquiales primarias (Fig. 7b). Estas lesiones disminuyeron en G3 expuesto a neem en agua (Fig. 7c). En G4 expuesto a una alta concentración de plomo, se registraron edema severo y necrosis epitelial y cartilaginosa en las laminillas branquiales primarias (Fig. 7d), en comparación con un ligero edema e hipertrofia epitelial en G5 (Fig. 7e). Las puntuaciones de lesiones microscópicas en las branquias no mostraron una diferencia significativa entre los grupos, excepto en el edema y la infiltración leucocítica, que fueron significativamente más bajos en el G3 que en el G2 (Fig. 8).

(a – e) Branquias, (f – j) hepatopáncreas y (k – o) músculo de Oreochromis niloticus. (a) Estructura histológica normal en G1. (b) Hipertrofia epitelial de las laminillas branquiales, infiltración de células inflamatorias y edema en las laminillas branquiales primarias en G2 en comparación con (c) disminución del edema en G3. (d) Edema severo y necrosis del cartílago en las laminillas branquiales primarias en G4 en comparación con (e) edema leve e hipertrofia epitelial en G5. (f) Estructura histológica normal en G1. (g) Degeneración vacuolar severa, cariopicnosis y necrosis de hepatocitos en G2, (h) que disminuyó en G3. (i) Necrosis masiva de hepatocitos con cuerpos hialinos intracitoplasmáticos y disociación de hepatocitos en G4, (j) que disminuyó en G5. (k) Estructura histológica normal en G1. (l) Degeneración y separación de fibras musculares con atrofia y necrosis de haces musculares y algunas infiltraciones leucocíticas en G2. (m) Edema leve y desintegración de algunos haces de músculos en G3. (n) Necrosis y pérdida de haces musculares en G4. (o) Separación y vacuolación de miofibrillas en G5 (tinción H&E, ×200).

Diagrama de caja de las puntuaciones histopatológicas. (a – c) Puntuaciones de lesiones branquiales. (d – f) Puntuación de lesión hepática. (g – k) Puntuaciones de lesiones musculares. Los cuadros representan el rango intercuartil (IQR). Las líneas medias gruesas son las medianas. Los valores máximo y mínimo están representados por finas líneas horizontales en la parte superior e inferior.

La microscopía del hepatopáncreas mostró una estructura histológica típica en G1 (Fig. 7f), pero reveló degeneración vacuolar severa, cariopicnosis y necrosis moderada de los hepatocitos en G2 (Fig. 7g), que disminuyó en G3 (Fig. 7h). En G4, hubo áreas masivas de necrosis de hepatocitos, necrosis de hepatocitos solitarios, cuerpos hialinos eosinofílicos intracitoplasmáticos y disociación de hepatocitos, además de necrosis de las células pancreáticas (Fig. 7i). Se observaron menos lesiones en G5 (Fig. 7j). Las puntuaciones de lesión hepática mostraron una diferencia significativa entre los grupos. La necrosis y la degeneración hepática disminuyeron considerablemente en G3 en comparación con G2 y en G5 en comparación con G4, pero no de manera significativa (Fig. 8).

La microscopía muscular en los grupos de tratamiento mostró más lesiones que G1, que tenía una estructura histológica normal (Fig. 7k). G2 mostró degeneración, separación de fibras musculares, atrofia y necrosis de haces musculares y algunas infiltraciones leucocíticas (Fig. 7L). Por el contrario, los músculos G3 tenían un edema leve y desintegración de algunos haces de músculos (Fig. 7m). En G4, la necrosis y la pérdida de haces musculares fueron más evidentes que con la dosis más baja (Fig. 7n). En G5 hubo separación y vacuolación de miofibrillas, que fue menos severa que en el grupo anterior (Fig. 7o). La gravedad de la degeneración, necrosis, atrofia y edema muscular aumentó significativamente por la exposición al plomo en G2 y G4 en comparación con el control. La necrosis muscular, la atrofia y la infiltración leucocitaria disminuyeron significativamente en G3 pero no en G5 (Fig. 8).

La estructura química del biosorbente influye en el proceso de adsorción de metales. La adsorción de iones metálicos se produce debido a la interacción de los grupos funcionales reactivos del biosorbente. Los componentes fitoquímicos del extracto de hoja de neem son alcaloides, carbohidratos, azúcares reductores, flavonoides, glucósidos, taninos, compuestos fenólicos y saponinas (archivo complementario). Los resultados de GC-MS mostraron la presencia de 38 compuestos. El nepetalactol (isocalamendiol) fue más alto en este extracto a RT 9,76 (9,39%), seguido del acetato de 7-metil-Z-tetradecen-1-ol a RT 10,66 (7,59%), ácido etanimidotoico a RT 5,33 (6,92%), sarrerosida a temperatura ambiente 15,87 (6,48%), amida d-gala-l-ido-octónica a temperatura ambiente 7,05 (6,27%), óxido de ledeno-(II) a temperatura ambiente 14,29 (6,01%), esteviósido a temperatura ambiente 6,77 (5,92%), carofileno óxido a temperatura ambiente 17,16 (4,78%), 1,3,5-triazina-2,4-diamina a temperatura ambiente 11,75 (3,99%), tridecanedial a temperatura ambiente 6,30 (3,92%) y otros compuestos diversos de cadena larga (38,73%) .

Se han estudiado las concentraciones de metales pesados en cuerpos de agua cercanos a áreas industriales y las especies acuáticas que habitan dichos lugares para evaluar el grado de contaminación54. Se encontró que la concentración de plomo en el Canal Mariotteya excedía el límite permisible recomendado por la FAO42, que es similar a la concentración registrada en el presente ensayo. La toxicidad de concentraciones subletales de plomo en diversos órganos está mediada principalmente por la elevada producción de ROS, que posteriormente provoca la oxidación de biomoléculas y alteraciones patológicas.

La distribución del plomo en los órganos de tilapia silvestre que examinamos fue en el siguiente orden: hígado ˃ branquias ˃ músculo. La mayor concentración de plomo (11,08 ± 2,3 mg kg-1) se presentó en el hígado, mientras que la más baja se encontró en los músculos (4,69 ± 1,2 mg kg-1). Por el contrario, la mayor concentración de plomo se detectó en las branquias de C. gariepinus, O. niloticus y trucha arco iris55. Esto podría deberse a la diferencia en el tiempo de exposición, la concentración de plomo en el ecosistema acuático, el mecanismo adaptativo de las branquias y la naturaleza bioacumulativa del hígado.

MDA, GSH y la fragmentación del ADN son biomarcadores valiosos del estrés oxidativo provocado por el plomo en animales acuáticos56. En el presente trabajo, el porcentaje de fragmentación del ADN y la concentración de MDA (proteína mM g-1) en todos los tejidos de los peces después de la exposición al plomo aumentaron significativamente, mientras que disminuyeron significativamente en todos los tejidos del G3. Además, la concentración de GSH se redujo significativamente en los tejidos de todos los grupos de plomo, pero aumentó dramáticamente en el hígado de G3 en comparación con G2, lo que indica que 1 g L-1 de NLP podría proteger a los peces contra el daño oxidativo inducido por 5 mg L-1, pero no contra 10 mg L-1 de plomo. Nuestros resultados demostraron que la concentración de GSH en diferentes tejidos de tilapia Mariotteya del Nilo fue sustancialmente mayor que en los grupos expuestos al plomo. Estos resultados coincidieron con Shaukat et al.19, quienes observaron un aumento significativo en la actividad de la peroxidasa en el hígado y las branquias de Labeo rohita después de la exposición al plomo. Este hallazgo puede atribuirse a las defensas naturales, los mecanismos adaptativos y la acción compensatoria de las enzimas antioxidantes en diferentes tejidos contra la toxicidad inducida por los radicales libres57. Zhang et al.58 afirmaron que el estrés oxidativo intensivo podría estimular y activar la expresión genética que codifica enzimas antioxidantes para iterar el desequilibrio causado por el daño oxidativo.

Los niveles de MDA aumentaron en el cerebro de Clarias batrachus después de 60 días de exposición al plomo59, así como en Cyprinus carpio L., Oncorhynchus mykiss Walbaum y Acipenser baeri Brandt spp., y se redujo la actividad de SOD60. Además, los niveles totales de GSH y GSH/GSSG disminuyeron después de 7 días de exposición al plomo en el hígado del pez de agua dulce O. niloticus61. Zhang et al.58 atribuyeron la alteración del mecanismo adaptativo del GSH en el hígado del pez dorado Carassius auratus al alto consumo de GSH, lo que resultó en una reducción de la relación GSH/GSSG. Otros estudios de exposición al plomo han informado una reducción significativa en los niveles de GSH, SOD, GST y CAT en el hígado de Clarias gariepinus y O. niloticus62. El plomo provoca una elevación significativa de la actividad GPX en el hígado de O. niloticus61,63 y en el cerebro de Clarias batrachus59. Estos resultados indican que el plomo podría causar daño oxidativo a la célula a través de la producción de ROS mediante mecanismos de tipo Haber-Weiss y Fenton que posteriormente inducen peroxidación lipídica, modificaciones de proteínas y daño al ADN63. Además, la elevación de MDA reacciona con grupos amino de proteínas y otras biomoléculas para producir una variedad de aductos64. Estos aductos incluyen productos entrecruzados65 y aductos con bases de ADN que son mutagénicos66 y cancerígenos67.

La supresión de la síntesis de hemo es uno de los impactos importantes del plomo. El plomo inhibe la actividad de ALAD mediante la unión del grupo sulfhidrilo (SH), que es necesario para una actividad enzimática óptima68, o desaloja un ion zinc en la posición de unión al metal que posteriormente alterna la estructura cuaternaria de las enzimas69. En el presente análisis, la expresión del gen ALA-D se redujo significativamente en el hígado, las branquias y los músculos de la tilapia del Nilo salvaje y experimental sometida a diferentes concentraciones de plomo. Estos resultados coincidieron con Li et al.70, quienes demostraron que la exposición al plomo transmitido por el agua produce una regulación negativa de la transcripción de ALA-D. Una alta concentración de plomo en el hígado de Palaemonetes turcorum se correlaciona con la inhibición de la enzima ALA-D71. También se reportó un alto nivel de plomo en hígado y muestras de sangre de Prochilodus lineatus recolectadas de cuerpos de agua contaminados en Buenos Aires y La Plata con agotamiento de la actividad ALA-D72. ALA-D se considera un biomarcador específico de exposición al plomo debido a las correlaciones negativas entre la concentración de plomo en sangre y la inhibición de ALA-D en especies de peces73 y tejidos de invertebrados de agua dulce74.

Como consecuencia de la inhibición de ALA-D, δ-ALA se acumula en la sangre y estimula la generación de ROS75, lo que resulta en estrés oxidativo76. Además, el daño oxidativo del ADN debido a la acumulación de ALA se produce mediante la oxidación del ALA a ácido 4,5-dioxovalérico, un eficaz agente alquilante de restos de quinina tanto en los nucleósidos como en el ADN77. Del mismo modo, la acumulación de ALA da como resultado la sobreproducción de 8-oxo-7, 8-dihidro-2-desoxiguanosina y 5-hidroxil-2-desoxicitidina incriminadas en el daño al ADN inducido por ALA78 a través de la interacción con los sitios de unión de zinc en el ADN. proteína protamina asociada79. Además, el plomo induce neurotoxicidad porque el ALA es estructuralmente similar al ácido γ-aminobutírico y estimula los receptores del ácido γ-aminobutírico en el sistema nervioso69. En el presente estudio, la depresión de la expresión del gen ALA-D en diferentes tejidos se consideró un biomarcador importante relacionado con la contaminación ambiental.

La exposición de los peces a los metales puede provocar disfunciones en el sistema inmunológico, aumentando la tasa de mortalidad80. El plomo generalmente perjudica el sistema inmunológico de los peces y los hace más vulnerables a las infecciones, como sugirieron Paul et al.81. Los peces expuestos a 9,4 mg L-1 de acetato de plomo durante 4 días mostraron una reducción de la actividad fagocítica y del índice fagocítico después del desafío con S. aureus, inhibición de sustancias antimicrobianas como el óxido nítrico (NO) y la mieloperoxidasa (MPO), daños severos en el epitelio intestinal y la regulación negativa de la transcripción de TNF-α. En el presente estudio, se observaron granulomas con un área central de necrosis y cápsula fibrosa en varios órganos, que provocaron una respuesta inflamatoria circundante. Aunque se dispone de poca información sobre las bacterias que causan la formación de granulomas en la tilapia en Egipto, en otros países se ha informado de una amplia gama de infecciones bacterianas. Se han implicado y reportado muchas causas de formación de granulomas en la tilapia. Streptococcus agalactiae puede causar inflamación granulomatosa en los ovarios y los testículos82. Infección crónica por Pseudomonas spp. causa granulomas de tejido epiteliide y necrótico encapsulado83. Además, la inflamación granulomatosa está relacionada con Francisella noatunensis subsp. orientalis en tilapia cultivada (O. niloticus y O. aureus) en China84.

En el presente trabajo, el plomo provocó diversas lesiones en las branquias similares a las reportadas previamente85. También se registraron previamente lesiones musculares, como separación de haces de músculos y reducción de la compacidad86. Además, típicamente se observan lesiones hepáticas como inclusiones citoplasmáticas, hinchazón, degeneración hidrópica y necrosis87. Para disminuir el efecto patológico de la toxicidad del plomo, la planta de neem es una posible candidata que puede eliminar el plomo del agua, reduciendo así sus efectos tóxicos. El neem tiene muchas propiedades farmacológicas que pueden mejorar la calidad del agua88,89. El estudio actual muestra que agregar neem al agua puede reducir las lesiones patológicas en varios órganos inducidas por la toxicidad del plomo. Esto fue muy evidente en G3 pero no en G5 expuesto a la alta concentración de plomo, lo que podría deberse a la saturación del neem con plomo en G5. Bhattacharyya y Sharma44 encontraron que 1,2 g L-1 de PNL podrían eliminar hasta el 93% del plomo en 96 h de una solución de 300 mg L-1 utilizando tecnología de adsorción por lotes. La absorción mejoró constantemente en el rango de pH de 2 a 7, más allá del cual la adsorción no pudo realizarse debido a la precipitación del metal. La adsorción de cationes metálicos depende de la naturaleza de la superficie adsorbente, la distribución del catión metálico y el pH del sistema. Dependiendo del pH de la solución, los grupos funcionales orgánicos en la superficie del adsorbente pueden cargarse positiva o negativamente. La superficie del carbón activado se carga negativamente a valores de pH superiores a pHzpc (carga de punto cero) debido a la ionización de grupos superficiales ácidos de carbono-oxígeno, y los grupos superficiales exhiben una potente atracción electrostática hacia las especies metálicas. Al analizar la cromatografía del extracto del árbol de neem utilizando GC-M, el extracto contenía muchos grupos funcionales de carbono orgánico, alifáticos y aromáticos de cadena larga. Las propiedades de estos compuestos deberán evaluarse en el futuro. Los compuestos aromáticos contienen grupos centrales activos como hidroxilo (OH-) y cetonas (C=O) y contienen alta electronegatividad de átomos como nitrógeno (N2), azufre (S) y silicio (Si). Los compuestos heterocíclicos, incluidos los polisacáridos y los carbohidratos, tienen muchos centros activos y átomos electronegativos. Todos los grupos activos, átomos electronegativos, compuestos polisacáridos, carbohidratos y átomos de oxígeno, en el caso del estado iónico, tienen ionización parcial que puede adsorber el elemento plomo ionizado en solución, y esta adsorción es tanto química como física90. La tendencia de coordinación de los electrones aromáticos a donar grupos que involucran grupos hidroxilo, éter y fenilo es muy superior a la de los grupos alifáticos correspondientes. La alta tendencia a la coordinación de derivados aromáticos proviene de su mayor densidad electrónica y su capacidad para participar en la conjugación. Esta conjugación alivia los complejos metálicos producidos. Como resultado, la tendencia a la coordinación y la formación de complejos de la lignina es mucho mayor que la de la celulosa y la hemicelulosa. Por lo tanto, la absorción de metal por parte de la PNL puede estar relacionada con su mayor contenido de lignina. Además, estudios previos han encontrado que el pH alcalino del medio acuático aumenta la disociación de grupos funcionales como el OH y el C-OH carbonoso de la fibra, lo que en consecuencia aumenta la absorción de metales (eficiencia de adsorción) del biosorbente91.

Los análisis químicos de muestras de agua y órganos de peces recolectados en el Canal Mariotteya mostraron una alta concentración de plomo que excedía los límites permisibles de la FAO. La exposición crónica subletal al plomo en el ambiente acuático produce estrés oxidativo, efectos genotóxicos y diversas alteraciones patológicas en la tilapia del Nilo en este lugar. Las muestras de tejido (branquias, hígado y músculo) recolectadas de tilapia silvestre y tilapia experimental expuestas a 5 a 10 mg L-1 de acetato de plomo mostraron un aumento en la peroxidación lipídica y la oxidación del ADN, así como una reducción en los sistemas de defensa antioxidantes y el nivel de expresión de UN CHICO. Las lesiones patológicas se correlacionaron directamente con la concentración de plomo. El polvo de hoja de neem a 1 g L-1 mitigó el estrés oxidativo y las lesiones patológicas de la toxicidad del agua con 5 mg L-1 de acetato de plomo en un régimen de exposición estática.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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El primer autor quisiera agradecer a la Autoridad de Financiación de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) y al Banco Egipcio de Conocimiento (EKB) por financiar el acceso abierto.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB).

Departamento de Medicina de Animales Acuáticos, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, Egipto

Nermeen M. Abu-Elala y Nehal A. Younis

Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Internacional Rey Salman, Sinaí del Sur, Egipto

Nermeen M. Abu-Elala

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, 12211, Egipto

Marwa S. Khattab

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, 12211, Egipto

Huda O. Abu Bakr

Departamento de Inmunología, Instituto de Investigación en Sanidad Animal, Dokki, Giza, Egipto

Samuel Helmy

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad del Canal de Suez, Ismailia, 41522, Egipto

Ahmed Hesham

Medio Oriente para la Vacuna Veterinaria (MEVAC), El-Salihya El-Gededa, 44671, El-Sharkia, Egipto

Ahmed Hesham

Departamento de Producción Animal, Facultad de Agricultura, Universidad Kafrelsheikh, Kafr El-Sheikh, 33516, Egipto

Mahmoud AO Dawood

Centro de Investigación Aplicada sobre Medio Ambiente y Sostenibilidad, Universidad Americana de El Cairo, El Cairo, 11835, Egipto

Mahmoud AO Dawood

Facultad de Agricultura, Universidad de Tanta, Tanta, 31527, Egipto

Mohammed F. El Basuini

Facultad de Agricultura del Desierto, Universidad Internacional Rey Salman, Sinaí del Sur, 46618, Egipto

Mohammed F. El Basuini

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Todos los autores contribuyeron por igual a este manuscrito.

Correspondence to Mohammed F. El Basuini.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Abu-Elala, NM, Khattab, MS, AbuBakr, HO et al. El polvo de hoja de neem (Azadirachta indica) mitiga el estrés oxidativo y las alteraciones patológicas provocadas por la toxicidad del plomo en la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus). Representante científico 13, 9170 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36121-4

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Recibido: 10 de enero de 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 06 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36121-4

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