Estrategias de tratamiento del estiércol de cerdo para mitigar la propagación de la resistencia a los antibióticos

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11999 (2023) Citar este artículo

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Debido al riesgo de que las bacterias patógenas resistentes a los antibióticos y sus genes de resistencia a los antibióticos se transfieran de las heces del ganado al suelo y a los cultivos, es imperativo encontrar tratamientos eficaces para el estiércol en las granjas para minimizar ese potencial peligroso. Una política mundial introducida de desarrollo sostenible, centrada en la producción agrícola ecológica y la economía circular destinada a reducir el uso de fertilizantes artificiales; por lo tanto, dichos métodos de tratamiento también deberían maximizar el valor de fertilización del estiércol animal. En este estudio se proponen dos estrategias para procesar el estiércol de cerdo: almacenamiento y compostaje. El presente estudio examina los cambios en las propiedades fisicoquímicas del estiércol tratado, en el microbioma y en el resistoma, en comparación con el estiércol crudo. Este es el primer análisis exhaustivo realizado en el mismo lote de estiércol. Nuestros resultados sugieren que, si bien ninguno de los procesos elimina el riesgo ambiental, el compostaje da como resultado una reducción más rápida y pronunciada de elementos genéticos móviles que albergan genes de resistencia a los antibióticos, incluidos los responsables de la resistencia a múltiples fármacos. En general, el proceso de compostaje puede ser una estrategia eficaz para mitigar la propagación de la resistencia a los antibióticos en el medio ambiente y reducir el riesgo de su transferencia a los cultivos y la cadena alimentaria, al tiempo que proporciona ingredientes fertilizantes esenciales.

La creciente demanda de carne ha provocado un aumento de la cría de cerdos en todo el mundo. La producción mundial anual de carne de cerdo ha aumentado en los últimos 50 años, alcanzando aproximadamente 120 millones de toneladas en 2018. Se estima que el consumo total de carne de cerdo aumentará un 13% en 2030 y un 22% en 2050 en comparación con 20201. Los principales productores de carne de cerdo son China ( 45% de la producción mundial), seguidos de Estados Unidos, Alemania, España y Vietnam2, países que representan casi el 65% de la producción mundial de carne de cerdo. Mientras que en la UE los antibióticos solo se aplican para tratar infecciones bacterianas, en algunos otros países también se aplican comúnmente para promover el crecimiento y aumentar la eficiencia de la producción; en estos países, cada año se aplican aproximadamente 66.667 toneladas de antibióticos al ganado en todo el mundo3. Sin embargo, debido al vínculo observado entre el uso de antibióticos en el ganado y la aparición de resistencia a los antibióticos en bacterias patógenas, el uso de antibióticos como promotores del crecimiento está siendo limitado y está prohibido en la UE desde 20064; también ha estado restringido en Estados Unidos desde 20175 y en China desde 20206. Sin embargo, China sigue siendo el mayor productor y consumidor de antibióticos, y el 52% se utiliza en la producción animal7.

Si bien la microbiota gastrointestinal porcina alberga una población diversa de bacterias que se sabe que apoyan la salud del huésped, también pueden ser una fuente de genes de resistencia a los medicamentos. Las explotaciones ganaderas intensivas se caracterizan por una combinación de una alta carga bacteriana y una alta presión de selección de antimicrobianos: condiciones que se sabe que promueven la aparición de bacterias resistentes a los antimicrobianos (BRA) y genes de resistencia a los antibióticos (ARG)8. Además, las alteraciones en la microbiota intestinal pueden mejorar la transferencia de ARG o aumentar la abundancia de ARB secretados por el animal.

Normalmente, más de la mitad de la dosis administrada de antibióticos se excreta sin cambios en la orina y las heces. Sólo una pequeña cantidad de antibióticos son metabolizados parcialmente por el animal huésped, produciendo metabolitos microbiológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, en el hígado, la enrofloxacina se metaboliza parcialmente (< 25%) a ciprofloxacina, mientras que las sulfonamidas se metabolizan en pequeña medida a las N4-acetilosulfonamidas, menos activas; en ambos casos, los productos son microbiológicamente activos9.

Como un solo cerdo puede producir hasta 6,4 kg de estiércol húmedo por día10, las grandes instalaciones de cría de animales producen grandes cantidades de heces animales, lo que resulta en la producción de 1,7 mil millones de toneladas de heces anualmente en todo el mundo11. Sólo en las granjas porcinas de Alemania, España, el Reino Unido y los Países Bajos, la producción anual de estiércol asciende a más de 120 millones de toneladas12. La forma más fácil y económica de eliminar estos residuos es aplicarlos al suelo; sin embargo, se ha identificado que el estiércol de ganado es un reservorio de antibióticos, ARG y BRA potencialmente patógenos, lo que representa una amenaza considerable para la salud humana y animal. De hecho, el estiércol de cerdo se considera una fuente clave de propagación de la resistencia a los antibióticos al medio ambiente13,14. Ciertamente, se sabe que la aplicación directa de estiércol procedente de animales de granja tratados con antibióticos expone las zonas agrícolas a altos niveles de antibióticos. Dependiendo de las propiedades fisicoquímicas del antibiótico y de la composición del suelo, los compuestos pueden permanecer en el suelo modificado con estiércol o pueden transferirse al suelo y a las aguas superficiales mediante lixiviación o escorrentía. Además, el agua puede transportar contaminantes a largas distancias y afectar a todo el ecosistema acuático. Además, la tasa de degradación varía según el tipo de antibiótico y, en muchos casos, puede ser muy baja hasta por 30 días14. Cuando están en el suelo, los compuestos pueden ser absorbidos por los cultivos, donde se acumulan y luego ingresan a la cadena alimentaria. Además, la presencia constante de bajas concentraciones de antibióticos y sus residuos activos en el ambiente favorece la selección de bacterias resistentes14.

La estrategia de manejo del estiércol más comúnmente aplicada es el almacenamiento, donde las heces simplemente se guardan en un lugar seguro designado durante un tiempo prolongado. Esto requiere suficiente capacidad de almacenamiento, ya que los períodos mínimos de almacenamiento antes de la dispersión varían de 4 a 7,5 meses, dependiendo del tipo de animal, el tiempo en el pasto y la ubicación geográfica15. Alternativamente, el estiércol también se puede convertir en abono: una práctica ambiental y económicamente beneficiosa para procesar desechos orgánicos sólidos, que permite una reducción eficiente del volumen, la eliminación de patógenos y la reducción del contenido de antibióticos16. El almacenamiento y el compostaje forman parte de los principios de la química verde; sin embargo, el compostaje de estiércol puede plantear preocupaciones ambientales legítimas17,18,19. El metano se forma como resultado de la descomposición anaeróbica de la materia orgánica. En condiciones aeróbicas, el metano se oxida a dióxido de carbono, que contribuye menos que el metano al calentamiento global. Un proceso de compostaje realizado incorrectamente puede provocar un aumento de las emisiones de metano. El sector agrícola contribuye más a las emisiones antropogénicas de metano (50,63%), pero las emisiones relacionadas con las prácticas de manejo del estiércol constituyen la parte más pequeña (59,84% relacionada con la fermentación entérica, seguida por las emisiones del cultivo de arroz, otras prácticas agrícolas y gestión del estiércol) y sigue disminuyendo (medido de 1990 a 2010)20. En el estudio propuesto, nos centramos en el estiércol de cerdo, no en el purín de cerdo. El material líquido (purín de cerdo), cuando se almacena en fosas o lagunas de estiércol, tiene mayor probabilidad de desarrollar procesos anaeróbicos y por tanto desarrollar una mayor producción de metano que en el caso del estiércol seco21. Sin embargo, es difícil determinar de antemano la producción de metano a partir del sistema de gestión, ya que depende de la composición del estiércol, las condiciones de almacenamiento/compostaje (pH, temperatura, humedad o contenido de C/N), el tipo de animal o incluso la dieta de los animales20.

Actualmente, existen pocos datos sobre la distribución de ARG en estiércol sólido porcino y su estructura de comunidad microbiana; además, ningún estudio ha comparado el compostaje y almacenamiento de material obtenido de la misma fuente. El objetivo del presente estudio es evaluar el papel del estiércol de cerdo como un punto crítico para la propagación de ARG en el medio ambiente, incluso considerando el estricto control de la aplicación de antibióticos al ganado en los países miembros de la UE. Los hallazgos resaltan la necesidad de introducir compostaje para tratar el estiércol antes de su aplicación al suelo, en lugar de su almacenamiento. También determina el potencial de transmisión de ARG mediante la identificación de las correlaciones entre los filos microbianos y los grupos de ARG, y entre los ARG y los elementos genéticos móviles (MGE) observados durante el almacenamiento y el compostaje. Para determinar cuál es la mejor manera de reducir la propagación de la resistencia a los antimicrobianos antes de aplicar estiércol en los campos, el estudio compara los efectos de dos estrategias de gestión del estiércol comúnmente utilizadas, el almacenamiento y el compostaje, a escala de laboratorio. Al realizar los análisis, asumimos el tipo de proceso como variable independiente, y la abundancia relativa de ARG y la abundancia relativa del filo microbiano como variables dependientes. Es importante señalar que todas las muestras utilizadas en los dos métodos se recolectaron de los mismos animales de una sola granja y en el mismo momento. El análisis consiste principalmente en qPCR de alto rendimiento para determinar los cambios en la distribución de ARG en todas las muestras y protocolos de secuenciación dirigidos a las regiones variables V3-V4 del ARNr 16S para permitir la identificación de la comunidad microbiana.

La muestra de estiércol de cerdo se recogió de una granja comercial polaca de engorde en la primavera (abril) de 2019. El estiércol y el purín se separaron en la granja. Una fracción sólida se recogió en dos bidones de plástico azul de aproximadamente 20 L cada uno (uno para compostaje y otro para almacenamiento), y se llevó al laboratorio antes de su posterior procesamiento y análisis. El propietario de la granja aceptó tomar muestras de estiércol y compartió el historial del uso de antibióticos en la granja. La ubicación específica de la granja y los detalles del agricultor no se divulgan debido a restricciones de privacidad. Los antibióticos se aplicaron de acuerdo con la legislación de la UE: Reglamento (UE) 2019/61 sobre medicamentos veterinarios y Reglamento (UE) 2019/4 sobre piensos medicamentosos22. La piara de cerdos consta de 200 cerdos (50 cerdos por corral), con un aumento de peso de 1100 g/día/cerdo. Dieta utilizada: 80% harina de cereales de finca propia, 20% pienso complementario: base proteica, harina de soja o colza + vitaminas, micro y macronutrientes.

Se mezclaron 5 kg de estiércol de cerdo con aserrín de abeto Sitka en una proporción de 4 (estiércol): 1 (aserrín) (p/p) y se colocaron en un balde. El aserrín se obtuvo de la ferretería local. Se determinó el contenido de materia orgánica, nitrógeno total, fósforo, calcio, magnesio y metales pesados ​​(Cr, Cu, Cd, Ni, Pb, Zn, Hg) en el estiércol crudo y después del almacenamiento (4 M) y compostaje (10 W): Contenido de Hg según el procedimiento descrito en DIN ISO 16772, otros metales pesados ​​(ICP-OES/ICP-MS)–DIN EN ISO 11885/DIN EN ISO 17294-2, nitrógeno total–VDLUFA, Bd. Yo, Kap. A 2.2.1, nitrógeno amoniacal – DIN 38406 E5-1 mod., materia orgánica seca – DIN EN 12879. Sólo se determinó el contenido de Hg y materia orgánica seca de acuerdo con la norma acreditada específica; Los demás componentes fueron analizados según procedimientos descritos en normas pero ajustados a nuestras necesidades.

Aunque la duración de ambos procesos difiere, los períodos de compostaje y almacenamiento se aplicaron de acuerdo con las prácticas comúnmente utilizadas: el tiempo de almacenamiento de 4 meses se estableció siguiendo la legislación de la UE, y diez semanas fue tiempo suficiente para completar el compostaje como lo describe Ros. et al.23. Nuestro objetivo fue comparar las estrategias de tratamiento de estiércol comúnmente recomendadas junto con las duraciones sugeridas.

El recipiente con la mezcla se colocó en el laboratorio bajo campana ventilada a temperatura ambiente. El compost se volteó (mezcló bien) cada semana durante diez semanas. La temperatura, la humedad y el pH se midieron en el compost a aproximadamente 15 cm (la mitad de la altura de la mezcla) cada semana. El contenido de humedad se midió periódicamente y se ajustó al 50-60 % agregando agua MilliQ estéril (para evitar una posible contaminación con ARG o bacterias). El experimento se realizó por triplicado. Las muestras para el análisis microbiológico y molecular se recolectaron al inicio, a la mitad (quinta semana) y al final del proceso (décima semana).

El recipiente con el material se colocó en el laboratorio bajo campana ventilada a temperatura ambiente; sin embargo, el material no se mezcló. La temperatura, la humedad y el pH se midieron en el material a aproximadamente 15 cm (la mitad de la altura) cada semana. El experimento se realizó por triplicado. Las muestras para el análisis microbiológico y molecular se recolectaron al inicio del proceso, a la mitad (segundo mes) y al final (cuarto mes).

Recolectamos un total de 200 muestras en todo el experimento. Tomamos 40 muestras por grupo recogidas de tres repeticiones técnicas por grupo (control, muestras compostadas a las cinco semanas y diez semanas y muestras almacenadas a los dos meses y cuatro meses). El ADN aislado del grupo se reunió según los grupos y se envió para análisis.

Se aisló el ADN total de 500 mg de la muestra de estiércol utilizando el kit FastDNA™ SPIN para heces (MP Biomedicals) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La calidad y cantidad del ADN extraído se analizaron con un fluorómetro Invitrogen Qubit 4.0 (kit de ensayo de alta sensibilidad de ADNds) y un espectrofotómetro Colibri (Titertek Berthold). Las muestras de ADN se aislaron por triplicado y luego se combinaron para obtener una única muestra de ADN para cada punto temporal.

Las características de la estructura de la comunidad bacteriana se determinaron mediante la secuenciación del ARNr 16S dirigida a las regiones variables V3-V4 del ARNr 16S bacteriano. Siguiendo las recomendaciones del fabricante, las bibliotecas se prepararon con el kit de índice Nextera® XT v2 Set A (Illumina). Luego, los amplicones preparados se sometieron a secuenciación de alto rendimiento utilizando la plataforma MiSeq Illumina para generar secuencias de extremos pares de 2 × 300 pb en la Instalación de Secuenciación de ADN y Síntesis de Oligonucleótidos (Instituto de Bioquímica y Biofísica de la Academia Polaca de Ciencias). Las secuencias sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el software Qiime224 con la opción DADA2 para el control de calidad de la secuencia y la versión más reciente de la base de datos de secuencias de ARN ribosómico SILVA para la asignación de taxonomía25,26. Los datos obtenidos se analizaron y visualizaron utilizando MicrobiomeAnalyst27.

La matriz qPCR se realizó en el sistema de PCR en tiempo real SmartChip de Resistomap (Finlandia). Las condiciones del ciclo de qPCR y el procesamiento de datos inicial se realizaron como se describió anteriormente28. Se utilizó la misma plantilla de cebadores de 384 pocillos para cada muestra de ADN. Se realizaron tres réplicas técnicas para cada muestra. Las muestras utilizadas para el análisis tienen una calidad similar: proporción 260/280 de 1,8–2,0 (+/−0,1) y una concentración de 10 ng/μl. La concentración de la muestra se midió mediante el fluorímetro Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) y la calidad mediante un espectrofotómetro Colibri (Titertek Berthold). Sólo se analizaron muestras que cumplían los criterios descritos. Después de la amplificación basada en el ciclador de PCR qPCR SmartChip Real-Time (Takara), los valores del ciclo umbral (CT) se calcularon utilizando los parámetros predeterminados proporcionados con el software de análisis SmartChip; los genes y las secuencias de cebadores se enumeran en el archivo complementario 4. Los nombres y grupos de genes enumerados y categorizados en la hoja 1 del archivo complementario 4 se utilizan en todo el manuscrito.

La curva de fusión y el análisis de eficiencia de qPCR se realizaron en todas las muestras para cada conjunto de cebadores. Los amplicones con curvas de fusión inespecíficas y múltiples picos de perfil de pendiente se consideraron falsos positivos y se descartaron del análisis. Se tomaron muestras que cumplían los siguientes criterios para análisis adicionales: (1) valores de Ct ≤ 27, (2) al menos dos réplicas, (3) eficiencia de amplificación en el rango de 1,8 a 2,2. El número de copias relativo se calculó utilizando la ecuación. (1)29. Los números de copias del gen se calcularon normalizando los números de copias relativos por números de copias del gen 16S rRNA.

El tamaño mínimo de muestra se calculó utilizando el software G*Power (versión 3.1.9.7)30,31.

Los datos obtenidos de la secuenciación metagenómica dirigida a las regiones V3-V4 del gen 16S rRNA y la qPCR de alto rendimiento se recopilaron en archivos Excel (Microsoft Office 2019) y se adjuntan en archivos xlsx como materiales complementarios. El cálculo de la prevalencia de ARG se realizó en Excel según la ecuación. (1).

Los resultados de la secuenciación de la comunidad bacteriana y la prevalencia de los grupos de genes de resistencia a los antibacterianos se analizaron y visualizaron utilizando el servidor web MicrobiomeAnalyst 2.027. Para la determinación de la riqueza y diversidad de la comunidad bacteriana se utilizaron los índices de Shannon y Chao1. Las diferencias entre los parámetros mencionados anteriormente se determinaron mediante pruebas no paramétricas de análisis de varianza unidireccional de Kruskal-Wallis. El análisis de coordenadas principales se realizó utilizando el índice de disimilitud de Bray-Curtis. Todas las herramientas fueron proporcionadas por la herramienta MicrobiomeAnalyst. Los parámetros difieren significativamente cuando p < 0,05.

Las relaciones entre ARG y MGE y entre ARG y taxones microbianos se determinaron utilizando el coeficiente de correlación no paramétrico de Spearman. El cálculo del coeficiente de correlación de Spearman y la visualización de datos se realizaron con GraphPad Prism 9 (Graph Pad Prism versión 9.0.0). Las relaciones analizadas se utilizaron para construir redes utilizando Cytoscape (Cytoscape versión 3.9.0). Las correlaciones se consideraron fuertes y significativas cuando el valor absoluto del rango de Spearman |r|> 0,7 y p < 0,0532.

Se encontró que el contenido de materia orgánica (MO) era estático después del almacenamiento, pero se observó un ligero aumento después del compostaje. Además, ambos conjuntos de materia tratada mostraron un enriquecimiento de N pero una reducción en la concentración de P, Mg y Ca en comparación con el valor inicial. Se encontró que el pH del estiércol aumentaba ligeramente de 7,0 a 7,4 durante el compostaje; sin embargo, se observó un aumento similar durante el almacenamiento. La humedad, el pH y la temperatura se midieron durante el proceso de manera semanal durante diez semanas. Las concentraciones de metales pesados ​​se mantuvieron por debajo de los estándares aplicables en la UE considerados seguros. Todos los resultados se presentan en las Tablas S1 y S2 (archivo complementario 1).

La composición de las comunidades bacterianas a nivel de filo se presenta utilizando el tipo de gráfico de abundancia relativa (Fig. 1). Los datos están disponibles como archivo complementario 2.

Composición microbiana de muestras a nivel de filo. Las muestras se dividieron en tres grupos: control (PM cruda; muestra antes del tratamiento), compostadas (MP compostaje 5 W, PM compostaje 10 W; muestras compostadas después de cinco y diez semanas, respectivamente) y almacenadas (PM almacenada 2 M, PM almacenada 4 M; muestras almacenadas después de dos meses y cuatro meses, respectivamente); Los diagramas de barras apilados representan el valor promedio de tres réplicas.

La abundancia relativa de Bacterioidetes disminuyó después de cinco semanas (18,8%) y luego aumentó después de diez semanas (43,6%) durante el compostaje; sin embargo, este valor disminuyó después de dos meses (14,7%) y luego aumentó a los cuatro meses (51,3%) durante el almacenamiento. La abundancia relativa de Firmicutes aumentó después de cinco semanas (30,2%) y disminuyó después de diez semanas (21,7%) durante el compostaje, pero aumentó continuamente durante el almacenamiento (28,5% y 52,8, después de dos y cuatro meses, respectivamente). La abundancia relativa de Proteobacteria aumentó tanto durante el compostaje (13,8% después de cinco semanas y 28,8% después de diez semanas) como durante el almacenamiento (28,2% después de dos meses y 55,5% después de cuatro meses). Finalmente, la prevalencia de Actinobacteria inicialmente aumentó (10,6%) pero luego disminuyó en las últimas etapas (3%) durante el compostaje; sin embargo, su nivel aumentó continuamente desde el 16,4% después de dos meses y el 21,8% después de cuatro meses de almacenamiento.

La riqueza y diversidad de las comunidades microbianas se analizaron mediante los índices de Shannon y Chao1 (Fig. 2). El índice de Shannon mostró valores más bajos durante el almacenamiento y el compostaje que las muestras de control no tratadas, pero sólo como tendencia. El índice Chao1 también mostró valores más bajos durante el almacenamiento y el compostaje que las muestras de control no tratadas en el nivel de tendencia. Se utilizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para determinar las diferencias entre todas las muestras según el índice de disimilitud de Bray-Curtis; el gráfico PCoA no mostró diferencias entre las muestras dependiendo de las estrategias de manejo (incluido el estiércol no tratado).

(A) Índices de Shannon de diversidad de la comunidad microbiana (valor de p 0,07 [Kruskal-Wallis]) (B) Índices de Chao 1 de riqueza de la comunidad microbiana (valor de p 0,1 [Kruskal-Wallis]); las muestras se dividieron en tres grupos: control (PM cruda 1, PM cruda 2, PM cruda 3; muestras antes del tratamiento), compostadas (PM compostaje 5W, PM compostaje 10W; muestras compostadas después de cinco y diez semanas, respectivamente) y almacenadas. (PM almacenado 2 M, PM almacenado 4 M; muestras almacenadas después de dos y cuatro meses, respectivamente).

Aunque los índices de Shannon y Chao1 no difieren significativamente, la composición de la comunidad microbiana varió entre el estiércol de cerdo tratado y el crudo. Muchos filos bacterianos disminuyen durante el compostaje y el almacenamiento, pero no aparece ninguno (archivo complementario 3).

Las abundancias relativas de las clases de genes analizados y MGE variaron durante el compostaje y el almacenamiento (Fig. 3) (los datos sin procesar están disponibles como archivo complementario 4). En ambos casos, se observó una mayor abundancia total de genes detectados en el estiércol tratado en comparación con el no tratado; sin embargo, se encontró que la distribución de los ARG individuales y de los grupos de ARG difiere según el tipo de tratamiento. Los cambios en la presencia de genes individuales se visualizan mediante un mapa de calor (archivo complementario 5). En el estiércol crudo, el mayor número de genes detectados se asoció con la resistencia a la tetraciclina, seguida de la resistencia a los aminoglucósidos, MLSB y sulfonamidas. Las abundancias más bajas se detectaron para los genes de resistencia al fenicol, la vancomicina y la trimetoprima.

Abundancias relativas de genes de resistencia a los antimicrobianos detectados y clases de genes de elementos genéticos móviles detectados durante el análisis de qPCR. Las muestras se dividieron en tres grupos: control (PM cruda; muestra antes del tratamiento), compostadas (MP compostaje 5 W, PM compostaje 10 W; muestras compostadas después de cinco y diez semanas, respectivamente) y almacenadas (PM almacenada 2 M, PM almacenada 4 M). M; muestras almacenadas después de dos y cuatro meses, respectivamente); Los diagramas de barras apilados representan el valor promedio de tres réplicas.

El compostaje provoca un aumento temporal en la cantidad total de genes detectados a 1,23 copias de genes/copias del gen 16S rRNA después de cinco semanas, seguido de una disminución a 0,77 copias de genes/copias del gen 16S rRNA después de diez semanas. El proceso de compostaje provocó una disminución en el número total de genes de resistencia a la tetraciclina; también resultó en una disminución en el número de genes de resistencia a MLSB, betalactámicos, fenicol y vancomicina, así como genes que se sabe que ofrecen resistencia contra otros antimicrobianos. El compostaje también provocó una reducción en las cantidades relativas de genes responsables de la resistencia a múltiples fármacos (MDR), así como en la abundancia relativa de genes clasificados como integrones. Sin embargo, el proceso resultó en un aumento en las cantidades totales de genes de resistencia a aminoglucósidos y genes de resistencia a sulfonamidas, así como en la cantidad de MGE.

Por el contrario, durante el almacenamiento, la abundancia relativa de genes aumentó a 1,31 copias de genes/copias del gen 16S rRNA después de dos meses, y luego disminuyó después de cuatro meses (1,29 copias de gen/copias del gen 16S rRNA). El proceso de almacenamiento provocó una disminución en los genes de resistencia a tetraciclina, MLSB, betalactámico y vancomicina, y se detectaron muchos genes de resistencia a aminoglucósidos, sulfonamidas, fenicol y trimetoprima después de cuatro meses de tratamiento. El almacenamiento también provocó un aumento en el número de genes de resistencia contra otros antimicrobianos, integrones y MGE. Para ambos procesos, el número de genes detectados se mantuvo elevado en comparación con el nivel inicial de 0,79/16S copias del gen rRNA. Sin embargo, en el caso del compostaje, todos los genes alcanzaron sus niveles más bajos después de la semana 10.

Si bien se encontró que la abundancia relativa de ARG aumentaba generalmente durante ambas estrategias de tratamiento, esta tendencia variaba según la clase de gen (Tabla S3, archivo complementario 1). La abundancia relativa de genes de resistencia a betalactámicos, tetraciclinas y vancomicina, genes que confieren el fenotipo de resistencia a MLSB y genes que codifican el fenotipo MDR se redujo al final del compostaje y al final del almacenamiento. Curiosamente, mientras que la abundancia relativa de integrones disminuyó durante el compostaje, su número de copias aumentó durante el almacenamiento. Se observó una situación similar con los genes de resistencia al fenicol: su abundancia disminuyó después del compostaje pero aumentó después del almacenamiento durante cuatro meses. Además, los genes de resistencia clasificados como otros disminuyeron después del compostaje y aumentaron después del almacenamiento. El número de copias de los grupos de ARG analizados restantes aumentó durante ambas estrategias de manejo del estiércol, pero el tamaño del cambio varió según el proceso.

La PCoA, las abundancias relativas de ARG y MGE en todos los grupos de muestras, calculadas según el método de distancia de Bray-Curtis, reveló una separación visual significativa entre las muestras iniciales (no tratadas) y tratadas con respecto a las abundancias relativas de clases de genes resistentes (p < 0,05) (Figura 4).

Análisis de coordenadas principales (PCoA) de las abundancias relativas de ARG y MGE en todos los grupos de muestras según el método de distancia de Bray-Curtis. Se utilizó el método estadístico ANOSIM. [ANOSIM] R: 0,98401; valor p < 0,001. Las muestras se dividieron en tres grupos: control (PM crudo 1, PM crudo 2; muestras antes del tratamiento), compostadas (PM compostaje 5W, PM compostaje 10W; muestras compostadas después de cinco y diez semanas, respectivamente) y almacenadas (PM almacenadas 2 M, PM almacenó 4 M; muestras almacenadas después de dos y cuatro meses, respectivamente).

El gen más prevalente en el estiércol de cerdo crudo fue aadE, seguido de tetM_1. Ambos genes se redujeron efectivamente tanto durante el compostaje como durante el almacenamiento. De los diez genes más comunes en el estiércol de cerdo crudo (aadE, tetM_1, tetM_3, tetPB_3, tnpA_2, qacEΔ1_2, tetQ, sul2_2, tetW, tetM_2, clasificados de mayor a menor), dos aumentaron después del tratamiento: tnpA_2 y qacEΔ1_2. La primera pertenece al grupo de transposasas IS21 y fue asignada durante este estudio al grupo MGE, mientras que la segunda codifica las bombas de eflujo, que es uno de los mecanismos responsables de la MDR. Tanto el compostaje como el almacenamiento provocaron una reducción en la abundancia del 80% de los genes detectados en el estiércol crudo; de estos, uno es un gen de resistencia a aminoglucósidos, seis son genes de resistencia a tetraciclina, uno es un MGE, uno es un mecanismo MDR y uno es un gen de resistencia a las sulfonamidas. La resistencia central de las muestras analizadas se presenta en la Fig. 5.

Resistencia central en muestras de estiércol de cerdo. InteractiVenn33 creó el diagrama de Venn, que presenta la cantidad de genes detectados en todas las muestras y su intersección. Las muestras se dividieron en tres grupos: PM crudo: estiércol de cerdo sin tratar, PM compost 10W: estiércol de cerdo después de 10 semanas de compostaje, PM almacenado 4 M: estiércol de cerdo después de cuatro meses de almacenamiento.

Se encontró que las estrategias de manejo del estiércol aplicadas redujeron solo parcialmente la diversidad de ARG (Tabla S4, archivo complementario 1). El número de integrones aumentó durante el almacenamiento de cuatro meses, pero disminuyó durante el compostaje. La cantidad de genes de resistencia a trimetoprima no se redujo durante ninguno de los procedimientos. Disminuyó el número de genes de resistencia a aminoglucósidos, betalactámicos, fenicol, sulfonamida, tetraciclina y vancomicina, genes que codifican el fenotipo de resistencia a MLSB, genes que confieren el fenotipo MDR, MGE y genes de resistencia contra otros antimicrobianos.

Se construyó una red de coocurrencia para determinar la relación entre 157 ARG y 21 MGE (integrones incluidos) durante el compostaje. Esta red (Fig. 6) contiene, en total, 179 nodos, y fue creada en base a 959 correlaciones fuertes (|r|> 0,9) y significativas (p ≤ 0,05) con 942 correlaciones positivas y 17 negativas. Los MGE mostraron más conexiones que los ARG, lo que indica un papel más importante en la formulación de redes. Entre el grupo de MGE e integrones, orf39-IS26, IncN_rep, IncQ_oriT, orf37-IS26, IS1111, tnpA_4, IncW_trwAB mostraron el mayor número de correlaciones con ARG. El resto de resultados se presenta en la Fig. 6.

Red de interacción ARG y MGE en compost. La red se presenta como un "diseño orgánico". Se muestra una correlación fuerte y significativa, basada en la correlación de rangos de Spearman, donde |r|> 0,9 y p < 0,05. El tamaño de los nodos representa el grado de interacción. Los bordes gris y naranja muestran correlaciones positivas y negativas entre ARG y MGE, respectivamente. El color de los nodos indicaba el tipo de ARG según la leyenda.

La relación entre 155 ARG y 19 MGE (junto con integrones) durante el almacenamiento se determinó mediante la construcción de una red de coocurrencia. El análisis abarcó 155 ARG y 19 MGE evaluados durante todo el proceso de almacenamiento. Esta red (Fig. 7) contenía un total de 152 nodos y fue creada en base a 1224 correlaciones fuertes (|r|> 0,9) y significativas (p ≤ 0,05) con 1211 correlaciones positivas y 13 negativas. Los MGE mostraron más conexiones que los ARG, lo que indica que desempeñan un papel importante en la formulación de redes. Entre el MGE y el grupo de integrones, orf39-IS26, IncN_rep, IncQ_oriT, orf37-IS26, IS1111, tnpA_4, IncW_trwAB, tnpA_5 tnpA_7, intI1_3, IS613, intI1_4, intI1_1, repA, tnpA_1, IS1247_2, tnpA_ 2, intI2_2, mostró el número más alto de correlaciones con ARG. El resto de resultados se presenta en la Fig. 7.

Red de interacción ARG y MGE en compost. La red se presenta como un "diseño orgánico". Se muestra una correlación fuerte y significativa basada en la correlación de rangos de Spearman, donde |r|> 0,9 y p < 0,05. El tamaño de los nodos representa el grado de interacción. Los bordes gris y azul muestran correlaciones positivas y negativas entre ARG y MGE, respectivamente. El color de los nodos indica el tipo de ARG según la leyenda.

Se investigaron las interacciones entre 26 filos y 12 clases de genes (10 clases de ARG, integrones y MGE) identificados durante el procedimiento de compostaje. La red de co-ocurrencia resultante (Fig. 8) contenía 37 nodos y se creó en base a 79 correlaciones fuertes (|r|> 0,85) y significativas (p ≤ 0,05) con 54 correlaciones positivas y 25 negativas. Como se muestra en la red, las clases de genes presentaron más interacciones que los filos microbianos, lo que indica que estos genes desempeñan un papel crucial en la construcción de la red de coocurrencia. Si bien los genes que codifican el mecanismo MDR demostraron la mayor interacción con los filos microbianos, los genes que codifican la resistencia a los aminoglucósidos, la trimetoprima y los genes asignados como Otra clase también exhibieron altos niveles de interacción. El nivel más bajo de conexiones se observó para integrones y MGE. El resto de resultados se presenta en la Fig. 8.

Análisis de la red de interacción de taxones microbianos y clases de genes durante el compostaje, presentado como un "diseño circular" basado en la coexistencia de grupos ARG y filos microbianos. Una conexión se correlaciona significativamente con |r|> 0,85 y p < 0,05 de Spearman. Los bordes gris y naranja representan las correlaciones positivas y negativas entre los grupos y filos ARG, respectivamente. El tamaño de los nodos muestra el grado de interacción. Los nodos verdes representan filos microbianos y los nodos azules representan grupos de ARG.

Se investigaron las interacciones entre 26 filos y 12 clases de genes (10 clases ARG, integrones y MGE) identificados durante el almacenamiento de estiércol de cerdo. La red de co-ocurrencia construida (Fig. 9) contenía 34 nodos y se creó en base a 58 correlaciones fuertes (|r|> 0,85) y significativas (p ≤ 0,05): 40 correlaciones positivas y 18 negativas. Aparte de Planctomycetes, todos los filos bacterianos demostraron correlaciones positivas o negativas con las clases de genes estudiados. De los filos, Planctomycetes demostró la mayor cantidad de correlaciones, es decir, tres positivas (MDR, MLSB y genes de resistencia a la tetraciclina) y cuatro negativas (MGE, integrones, genes clasificados como otros y genes de resistencia al fenicol). El resto de resultados se presenta en la Fig. 9.

Análisis de la red de interacción de taxones microbianos y clases de genes durante el almacenamiento, presentado como un "diseño circular" basado en la coexistencia de grupos ARG y filos microbianos. Una conexión está significativamente correlacionada cuando |r|> de Spearman 0,85 y p < 0,05. Los bordes gris y naranja representan las correlaciones positivas y negativas entre los grupos y filos ARG, respectivamente. El tamaño de los nodos muestra el grado de interacción. Los nodos verdes representan filos microbianos y los nodos azules representan grupos de ARG.

El objetivo a largo plazo del manejo del estiércol es eliminar los contaminantes ambientales: eliminar el gran volumen de desechos, utilizar su valor para mejorar la fertilidad del suelo y garantizar la bioseguridad. Por tanto, era necesario estudiar las propiedades fisicoquímicas del estiércol tanto tratado como sin tratar.

El estiércol de cerdo compostado tiene un pH alcalino, lo que contribuye a mantener o aumentar el pH del suelo; esto es de gran importancia para mantener el ciclo adecuado del nitrógeno y la disponibilidad de fósforo, y aumentar la absorción de micronutrientes por las plantas34,35. El uso de estiércol compostado para aumentar la materia orgánica de los suelos tiene una justificación agronómica y también es coherente con el plan de acción de economía circular de la UE36: mejora las condiciones físicas (estructura del suelo) y fisicoquímicas del suelo al aumentar sus propiedades de sorción (el papel del humus ) y contenido de sustancias orgánicas; esto estimula el microbioma del suelo, lo que a su vez desencadena una cadena adicional de cambios beneficiosos para las plantas37.

Para detener la propagación de ARG y microorganismos potencialmente patógenos desde las heces de los animales a los campos cultivables y luego a los cultivos, se han explorado varias estrategias de tratamiento previo del estiércol. Un objetivo importante a este respecto es identificar prácticas que puedan disminuir sus concentraciones en lugar de simplemente diluirlas38. La abundancia de ARG en el estiércol de ganado después del compostaje es muy variable. Depende de varios factores esenciales, entre ellos las tasas de reproducción y muerte de los microorganismos intestinales portadores de ARG, la presión que ejercen sobre ellos los residuos de antibióticos y los metales pesados, que favorecen la persistencia de genes de resistencia en la comunidad bacteriana, y la posibilidad de transferencia horizontal de genes. entre bacterias39.

Al cuantificar la resistencia a los antibióticos, es importante considerar que los cambios en la abundancia de genes de resistencia pueden deberse simplemente a cambios en la estructura microbiana subyacente, ya que la composición de la comunidad también puede influir en la composición de los genes de resistencia40. En el presente estudio, la comunidad bacteriana sufrió cambios durante el compostaje y almacenamiento; sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la riqueza o diferencias de la comunidad bacteriana, y solo se observaron tendencias generales en la diversidad y riqueza de la comunidad microbiana. Los filos más frecuentes observados en todas las muestras fueron Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria. Se ha descubierto que estos tres filos son los más abundantes en el microbioma intestinal de los cerdos41. En ambos casos, se observó que Bacteroidetes dominaba el estiércol crudo, con un número que disminuía a mitad del tratamiento y luego aumentaba hacia el final; sin embargo, si bien el compostaje dio como resultado que su nivel final fuera mayor que los niveles iniciales, el almacenamiento solo lo devolvió a los niveles iniciales. Para Proteobacterias y Actinobacterias, las cifras aumentaron en medio de ambos procesos; sin embargo, el número de actinobacterias disminuyó al final del compostaje. Firmicutes tiene una alta tolerancia a las altas temperaturas y, por lo tanto, es más abundante durante la fase termófila, mientras que Bacteroidetes prefiere temperaturas más bajas y es más abundante durante la fase de enfriamiento42. Do et al.43 obtuvieron resultados similares, pero con purines líquidos de cerdo en lugar de estiércol sólido; sin embargo, otros investigadores también han confirmado estas observaciones para el estiércol sólido de cerdo44,45,46. Aunque el almacenamiento es la tecnología de gestión del estiércol más comúnmente aplicada, pocos estudios han examinado su efecto sobre la comunidad bacteriana. Se ha descubierto que Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes son los filos bacterianos más prevalentes en el estiércol de cerdo durante el almacenamiento en diversas condiciones47, lo que concuerda con nuestros hallazgos actuales. Do et al.43 también informan que estos filos dominan en el estiércol almacenado en diferentes momentos.

El análisis de la red de filos bacterianos y grupos ARG en el estiércol compostado encontró que Proteobacteria coexiste con genes de resistencia a las sulfonamidas, Actinobacteria con genes de resistencia a los aminoglucósidos, Bacteroidetes con MGE y Firmicutes con integrones. Nuestros resultados concuerdan parcialmente con los de un análisis de coocurrencia realizado por Liu et. al.42, quienes encuentran que todos los filos bacterianos (Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria) que predominaron durante el compostaje están fuertemente asociados con genes de resistencia a tetraciclina, genes de resistencia a quinolonas y genes de resistencia a sulfonamidas. Además, Song et al.48 también encontraron que estos filos estaban asociados con genes de resistencia a macrólidos. Un análisis similar realizado en estiércol muestreado durante el almacenamiento encontró que Actinobacteria, Firmicutes y Proteobacteria estaban asociadas con los genes de resistencia a la trimetoprima y los genes de resistencia a los aminoglucósidos. Sin embargo, éstas sólo se calculan en base a las correlaciones de Spearman y deben evaluarse mediante experimentación: otros equipos de investigación pueden establecer parámetros o puntos de corte diferentes.

Aunque el compostaje es eficaz en la eliminación de antibióticos (aproximadamente el 64,7% de los antibióticos veterinarios detectables se eliminaron eficazmente del estiércol durante el compostaje)49 las situaciones relativas a la eliminación de ARG son más complicadas. Nuestro estudio detectó una elevada abundancia de ARG y MGE después de todas las estrategias de tratamiento de estiércol aplicadas; sin embargo, el aumento más pequeño se observó en las muestras recolectadas después de 10 semanas de compostaje. Cao et al.50 y recientemente Do et al.43 observaron aumentos similares en la prevalencia de genes de resistencia. Además, en el gráfico PCoA de ARG, el grupo asignado a las muestras iniciales no tratadas estaba claramente separado de los asignados al estiércol tratado; sin embargo, los dos grupos que pertenecen a muestras almacenadas y compostadas se superponen. A pesar de esto, la eficiencia de la eliminación de ARG y MGE no siempre es satisfactoria: algunos estudios reportan un aumento en sus abundancias relativas, mientras que otros reportan una disminución51. Un estudio sobre el compostaje de estiércol de cerdo arrojó las siguientes tasas de eliminación de genes divididos según grupos de antibióticos13: betalactámicos 36,8–73,7%, FCA 11,8–52,9%, MLSB 0–47,6%, tetraciclina 4,5–36,4%, vancomicina 0–71,4%, aminoglucósido 0-26,9% y sulfonamida 0%. En nuestro presente estudio, el compostaje resultó en reducciones de betalactámico (100%), vancomicina (100%), MLSB (86,36%), fenicol (83,33%), aminoglucósido (79,31%), otros (71,43%). %), genes de resistencia a tetraciclina (65,52%) y sulfonamidas (40%), sin que se observara reducción para los genes de resistencia a trimetoprim. Estos resultados sólo coinciden parcialmente con los nuestros. Aunque encontramos un aumento en la abundancia de MGE, como se informó anteriormente43, este aumento fue menor después del compostaje que después del almacenamiento.

En el presente estudio también se identificó el resistoma central que determina los genes de resistencia que no se eliminan mediante ningún tratamiento aplicado. Estos genes albergan resistencia a las tetraciclinas (tet36, tetA, tetQ, tetG, tetW, tetX, tetT, tetL, tetM), aminoglucósidos (aadA5, aadA1, strB, aadA2, aadA9), sulfonamidas (sul1, sul2), trimetoprima (dfrA1). , florfenicol (floR), antibióticos del grupo MLSB (lnuB, mefA), metales pesados ​​(merA), así como MGE (IntI1, intI2, tnpA, tnpA, IS1247) y genes que codifican el fenotipo MDR (qacEdelta1). Todos los genes enumerados albergan resistencia a grupos de antibióticos comúnmente utilizados en tratamientos médicos y veterinarios52.

Se sabe que el correcto desarrollo del compostaje depende de su fase activa y de curación. Pezzola et al.53 demostraron que la temperatura máxima alcanzable, el tiempo para alcanzarla y el pH y la humedad dependen del tipo de residuo utilizado y de los agentes de carga. Además, la dinámica de la eliminación de antibióticos parece estar estrechamente influenciada por la elección del agente de carga (aserrín de cáscara de arroz, residuos de hongos)49.

Aunque estos estudios concluyen que las condiciones de compostaje afectan la dinámica de eliminación de antibióticos y ARG del estiércol; ningún estudio ha intentado optimizar el proceso. Los estudios han encontrado que el tiempo y la temperatura del tratamiento son los factores clave que afectan los cambios en el nivel de ARG durante el tratamiento de lodos54,55.

Los estudios sobre los factores que determinan los perfiles de ARG durante el compostaje han encontrado que ciertos parámetros fisicoquímicos, por ejemplo, temperatura, pH, contenido de amoníaco y humedad, tienen un efecto más fuerte sobre los ARG que la presencia de bacterias huésped56,57,58. Si bien el compostaje es un proceso dinámico influenciado por la actividad combinada de una variedad de bacterias, actinobacterias y hongos, la dinámica de la población bacteriana está directamente influenciada por las condiciones ambientales, incluida la temperatura, el pH o la humedad; por ejemplo, si una especie de bacteria termófila porta los ARG, su abundancia puede aumentar durante la fase térmica59.

La transferencia horizontal de genes entre diferentes especies ha sido reconocida como un proceso evolutivo común y significativo60. Se demuestra más claramente en la estrecha interconexión entre la resistencia de las bacterias intestinales que habitan en el estiércol y los patógenos potenciales, bajo la presión selectiva constante de las sustancias antimicrobianas presentes en las heces. Los principales vasos del flujo genético en las comunidades microbianas son los plásmidos que unen distintos acervos genéticos61. Nuestros hallazgos actuales indican la presencia de plásmidos con una amplia gama de huéspedes tanto en muestras de estiércol crudo como en estiércol tratado con compostaje o almacenamiento. Los plásmidos de amplio rango de huéspedes pueden replicar y mantener de manera estable sus cargas genéticas en especies taxonómicamente distantes.

Nuestros hallazgos indican la presencia de plásmidos de los grupos de incompatibilidad Q, P, N y W (IncQ, IncP, IncN e IncW). Los plásmidos IncP pueden transferirse entre casi todas las especies de alfa, beta y gammaproteobacterias y replicarse en ellas. Los plásmidos IncQ son plásmidos de amplio rango de huéspedes que pueden proliferar en casi todas las bacterias Gram-negativas. Además, los plásmidos IncW e IncN pueden transferirse y replicarse en bacterias Gram-negativas62. La presencia de plásmidos móviles de amplia gama de huéspedes juega un papel clave en la diseminación de rasgos genéticos beneficiosos, incluida la resistencia a antibióticos, metales, compuestos de amonio cuaternario y colorantes de trifenilmetano, y la degradación de herbicidas, tanto dentro de la población de una determinada especie como fuera de ella. eso14,62.

Nuestro estudio también identificó IncP_oriT e IncQ_oriT; oriT es el origen de la replicación en los sistemas de transferencia de bacterias Gram negativas y es crucial para transferir ADN del donante al receptor. También se encontró que nuestras muestras incluían el gen repA, que codificaba la proteína de iniciación de la replicación, la ATPasa dependiente de ssDNA y la ADN helicasa, que muy probablemente se correlacionaban con el número de copias del plásmido63, un gen interno necesario para la transposición (tnpA), que es necesario para el reconocimiento, escisión e integración de elementos transponibles64, y algunas secuencias de inserción (IS): IS614 (que alberga ARG, por ejemplo, el gen cfiA)65,66, IS1247 (que codifica el fenotipo MDR–aac(6')IIc/ereA2/ acc/arr/ereA2)67 e IS1111 (que albergan ARG–blaGES-9)68.

Nuestro estudio comparó la abundancia de ARG y MGE en el estiércol de cerdo, tanto sin tratar como después del almacenamiento o compostaje. La aparición y difusión de los ARG está indudablemente relacionada con la presencia de MGE como plásmidos, transposasas e integrasas. Una red de coocurrencia construida a partir de los ARG y MGE encontrados en nuestras muestras confirmó la coocurrencia de MGE, integrones y ARG durante el compostaje y el almacenamiento. Aunque la red de co-ocurrencia para el estiércol tratado con almacenamiento tiene menos nodos que la construida durante el compostaje, incluyó correlaciones más positivas entre MGE y ARG, y estas también tendieron a ser más centralizadas: el grupo más grande en el grupo de almacenamiento incluye 10 MGE , frente a 7 MGE en compostaje. Nuestros hallazgos muestran claramente que incluso durante el compostaje o el almacenamiento, el estiércol animal debe considerarse un punto crítico de resistencia a los antibióticos en el que los MGE y los ARG están presentes juntos. El estiércol animal es un entorno rico en nutrientes habitado por una población bacteriana muy densa que, con la adición de antibióticos y metales pesados, crea condiciones favorables para la transferencia horizontal de genes. Se ha demostrado que la presencia de antibióticos en el estiércol aumenta la actividad de las transposasas, lo que resulta en una escisión o integración más frecuente de casetes genéticos en los integrones69.

Los genes tet, que resultaron ser los genes más frecuentes en el estiércol de cerdo no tratado, a menudo se identifican como componentes del plásmido. Su propagación se ve facilitada aún más por la inserción en transposones como Tn6298, Tn1721, Tn6303 o IS1216. Por ejemplo, se sabe que los genes tetW, tetQ, tetQ son comunes en la microbiota gastrointestinal del huésped, lo que indica que los genes demuestran una alta estabilidad dentro de la población69,70. Hasta la fecha, se han identificado tres genes de resistencia a las sulfonamidas: sul1, que se encuentra frecuentemente dentro de los integrones de clase 1, sul2, que se encuentra en un plásmido de amplio espectro de huéspedes en E. coli, y sul3, que también se encuentra junto con los integrones de clase 1 en una variedad de genes. de ambientes. Debido a su ubicación en los MGE, junto con integrones y transposones, los genes de resistencia a las sulfonamidas tienen un alto potencial de transferencia y pueden encontrarse en muchas especies bacterianas39.

El estiércol de cerdo también es relativamente abundante en genes de resistencia a los betalactámicos, ya que suelen recibir grandes cantidades de antibióticos pertenecientes a estos grupos. Los genes suelen estar ubicados dentro de plásmidos IncN71. Los plásmidos IncN pueden transportar blaCTX-M, lo que sugiere que desempeñan un papel crucial en la diseminación de cepas de BLEE en el estiércol. Además, los genes que codifican el fenotipo ESBL suelen localizarse en ISEcp1 o ISCR172. Los genes de resistencia a macrólidos (p. ej., ermB) y genes de resistencia a tetraciclina también pueden ubicarse en MGE, como la familia de transposones conjugativos Tn916-Tn1545. También se han encontrado otros genes interesantes en estiércol asociados con MGE, por ejemplo, el gen de resistencia a la colistina se ha encontrado en diversos tipos de replicones de plásmidos, como IncX4, IncI, IncFII, IncX1 e IncQ1, en E. coli39. Otros informes han señalado la presencia de genes de resistencia a carbapenemasas ampC, qnr, originados a partir de estiércol animal en plásmidos con una amplia gama de huéspedes, como los plásmidos de tipo replicón (IncP-1, IncQ, IncN, incW o IncF), lo que subraya su alto potencial de transferencia73.

Nuestros hallazgos revelan una alarmante diversidad y abundancia de ARG, lo que indica que el estiércol crudo de cerdo representa un reservorio ubicuo de ARG y MGE, lo que plantea un riesgo considerable de que los ARG se propaguen al medio ambiente cuando se liberan. La coexistencia de AGR y MGE aumenta el riesgo de transferencia de ARG de bacterias que habitan en animales de ganado y sus entornos a patógenos bacterianos asociados a humanos, lo que resulta en una mayor propagación entre las poblaciones humanas. La presencia de cepas resistentes limita la elección de posibles estrategias de tratamiento en caso de infección.

En general, se observaron correlaciones positivas entre la composición de la población microbiana y la presencia de ARG y MGE específicos y genes que codifican el mecanismo MDR, y entre ARG y MGE en todos los sistemas probados. Se descubrió que el compostaje y el almacenamiento dieron como resultado cambios diferenciales en las cantidades de grupos ARG, mientras que otros demostraron números de copias de genes más bajos o incluso más altos; sin embargo, se descubrió que los MGE eran uno de los grupos cuya abundancia aumentó durante ambos procesos.

La red de coexistencia que abarca tanto MGE como ARG implica que la transferencia horizontal de genes puede ocurrir no solo en el estiércol crudo, sino también durante el compostaje o el almacenamiento antes de la aplicación en el campo. Aunque la abundancia relativa de MGE generalmente aumenta durante ambos tratamientos y su prevalencia está asociada con una alta diversidad de genes de resistencia, se observa una menor abundancia general de MGE durante el compostaje que durante el almacenamiento; esto sugiere que, si bien el compostaje puede no ser suficiente para limitar completamente la propagación de ARG, es más eficiente que el simple almacenamiento.

Por lo tanto, se puede concluir que el uso de estiércol compostado es una estrategia más segura para asegurar la fertilidad del suelo y un alto contenido de humus. Representa una alternativa prometedora a los fertilizantes minerales, contribuyendo así a una forma más ecológica de cultivar los cultivos.

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo y como materiales complementarios o, en caso contrario, están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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La investigación fue financiada por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia (2017/25/Z/NZ7/03026), subvención en el marco del Horizonte Europeo 2020, en el marco de la Convocatoria Transnacional Conjunta JPI-EC-AMR (JPIAMR), JPI-EC- AMR JTC 2017, proyecto INART–“Intervención de la transferencia de resistencia a los antibióticos en la cadena alimentaria” para MP y parcialmente en el marco del programa “Iniciativa de Excelencia — Universidad de Investigación (2020-2026)” de la Universidad de Varsovia.

Departamento de Fisiología Bacteriana, Facultad de Biología, Instituto de Microbiología, Universidad de Varsovia, Varsovia, Polonia

Magdalena Zalewska, Aleksandra Błażejewska, Agnieszka Czapko y Magdalena Popowska

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MZ: Metodología, análisis formal, investigación, curación de datos, redacción: borrador original, visualización; AB—Análisis formal, investigación, redacción—Borrador original; AC—Investigación; MP—Conceptualización, Redacción—Revisión y edición, Supervisión, Administración de proyectos, Adquisición de fondos.

Correspondencia a Magdalena Popowska.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zalewska, M., Błażejewska, A., Czapko, A. et al. Estrategias de tratamiento del estiércol de cerdo para mitigar la propagación de la resistencia a los antibióticos. Informe científico 13, 11999 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39204-4

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Recibido: 19 de enero de 2023

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39204-4

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