Ciclo celular

Metabolismo de la naturaleza (2023)Citar este artículo

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Detalles de métricas

La homeostasis de los aminoácidos es fundamental para muchos procesos celulares. Está bien establecido que los aminoácidos se compartimentan utilizando gradientes de pH generados entre los orgánulos y el citoplasma; sin embargo, no se ha explorado la dinámica de esta partición. Aquí desarrollamos un indicador de pH altamente sensible y encontramos que el principal compartimento de almacenamiento de aminoácidos en Saccharomyces cerevisiae, la vacuola similar a un lisosoma, se alcaliniza antes de la división celular y se vuelve a acidificar a medida que las células se dividen. La dinámica del pH vacuolar requiere la absorción de aminoácidos extracelulares y la actividad de TORC1, la v-ATPasa y el ciclo del lípido vacuolar específico fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato, que está regulado por la quinasa dependiente de ciclina Pho85 (CDK5 en mamíferos). . La regulación vacuolar del pH permite el secuestro y movilización de aminoácidos del orgánulo, lo cual es importante para la función mitocondrial, la homeostasis de los ribosomas y el control del tamaño celular. En conjunto, nuestros datos proporcionan un nuevo paradigma para el uso de la compartimentación dinámica de aminoácidos dependiente del pH durante el crecimiento/división celular.

La vacuola similar a los lisosomas de levadura es el principal orgánulo degradativo y un sitio de almacenamiento de metabolitos, aminoácidos e iones esenciales para la aptitud celular en épocas de exceso y escasez de nutrientes1. La degradación macromolecular y el almacenamiento de metabolitos en el lisosoma/vacuola requieren el mantenimiento de una luz ácida en relación con el citosol, lo que se logra en gran medida mediante la ATPasa vacuolar altamente conservada, dependiente de ATP y bombeadora de protones (v-ATPasa)1. La regulación de la actividad v-ATPasa funcionaliza la vacuola para tomar decisiones proliferativas para la célula. A través de una relación recíproca con el regulador maestro del crecimiento TORC1, la vacuola integra diversas señales metabólicas como el flujo glucolítico y la disponibilidad de nitrógeno para activar vías celulares anabólicas o catabólicas2. Por lo tanto, la regulación de la v-ATPasa, el pH vacuolar y la señalización de TORC1 están funcionalmente entrelazadas para leer varios aspectos del metabolismo celular para tomar decisiones de crecimiento o no crecimiento.

Una función importante de la vacuola en la regulación de las decisiones proliferativas celulares se debe a su capacidad para almacenar aminoácidos. En particular, el grado de compartimentación de aminoácidos vacuolares es muy específico de clases particulares de aminoácidos. En la levadura, aproximadamente el 90% de los aminoácidos básicos intracelulares y el 10% de los aminoácidos ácidos se almacenan en la vacuola, mientras que todas las demás clases de aminoácidos sólo están moderadamente enriquecidas3.

No se comprende bien la importancia funcional de la compartimentación discreta de aminoácidos durante el crecimiento celular en condiciones repletas de nutrientes; sin embargo, recientemente se ha demostrado una consecuencia de la compartimentación desregulada. A medida que las células de levadura envejecen, el pH vacuolar aumenta y los niveles de cisteína citoplasmática aumentan, lo que afecta la función mitocondrial al alterar la biogénesis de los grupos hierro-azufre y la capacidad del orgánulo para llevar a cabo actividades críticas4,5. Esta comprensión de la importancia de la compartimentación de la cisteína vacuolar dependiente del pH en la función mitocondrial resalta la interconectividad de la homeostasis organelar durante el envejecimiento, pero plantea la cuestión de si la compartimentación de diferentes clases de aminoácidos en células jóvenes en crecimiento exponencial tiene algún papel.

Si bien se han descubierto muchos detalles sobre la regulación de la acidez vacuolar y el almacenamiento de metabolitos en condiciones de factores estresantes celulares como la inanición, el shock osmótico o el envejecimiento, la dinámica de la homeostasis del pH vacuolar en condiciones de crecimiento constante no se ha explorado debido a la escasez de herramientas moleculares. . Específicamente, no ha sido posible observar la dinámica del pH vacuolar en células individuales de levadura durante largos períodos de tiempo con alta resolución temporal y sensibilidad.

Aquí, exploramos la interconectividad de la regulación del pH vacuolar, la homeostasis de los aminoácidos celulares y el ciclo celular en la levadura. Desarrollamos un nuevo indicador fluorescente optimizado para el pH más bajo de la luz de la vacuola y lo utilizamos para descubrir una regulación del pH vacuolar ligada al ciclo celular que antes no se había apreciado en células que crecen en presencia de aminoácidos particulares. Identificamos varias vías moleculares altamente conservadas que regulan esta dinámica y proporcionamos evidencia del ciclo del lípido vacuolar fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato (PtdIns(3,5)P2), conocido por ser importante en la coordinación de la actividad de TORC1 y v- ATPasa. Además, demostramos que estos cambios de pH controlan la acumulación y liberación de aminoácidos en la vacuola. El bloqueo de la alcalinización dinámica del pH vacuolar en condiciones repletas de nutrientes conduce a una regulación positiva de los genes biosintéticos de arginina citoplasmática y a la regulación negativa concordante de la fosforilación oxidativa mitocondrial y los genes de los ribosomas. Fenotípicamente, esto conduce a una coordinación desregulada del tamaño en el que se producen las células hijas y el tiempo que pasan en G1 antes de comprometerse con una nueva ronda de síntesis de ADN.

Estos datos proporcionan evidencia de un control homeostático ligado al ciclo celular previamente inesperado de los niveles de aminoácidos citoplasmáticos y presentan un nuevo modelo para la regulación del pH vacuolar y la compartimentación de aminoácidos durante el crecimiento celular.

La falta de herramientas sólidas para monitorear los cambios de pH en orgánulos ácidos nos impulsó a crear un nuevo reportero. Para ello, mutamos la proteína fluorescente sensible al pH, la pHluorina supereclíptica (SEP)6, cambiando su pKa de fluorescencia para que sea más sensible a los cambios en ambientes ácidos. Introdujimos las mutaciones A227D/D147S en función de su efecto sobre la dependencia del pH del dominio fluorescente de ArcLight7 y denominamos al fluoróforo resultante, v-SEP (Fig. 1a). Para crear un indicador radiométrico localizado en vacuolar, se fusionó v-SEP con el fluoróforo rojo insensible al pH mCherry y se dirigió a la luz de la vacuola utilizando los primeros 50 aminoácidos de la hidrolasa carboxipeptidasa Y (CPY) vacuolar (Fig. 1b). .

a, Cambio de intensidad de fluorescencia de SEP (cuadrados azules) y v-SEP (cuadrados rojos) de células permeabilizadas in situ con digitonina y expuestas a soluciones de diferente pH. La fluorescencia se midió con un espectrofotómetro. El rango de pH vacuolar esperado está encuadrado en magenta. b, Un esquema del indicador ratiométrico sensible al pH compuesto por el fluoróforo v-SEP sensible al ácido y el fluoróforo mCherry insensible al ácido dirigido a la vacuola mediante la fusión N-terminal de los primeros 50 aminoácidos de la carboxipeptidasa Y (líder CPY). La micrografía muestra ambos fluoróforos localizados en la vacuola en una sola célula. c, Los datos de series de tiempo muestran la relación entre la intensidad vacuolar de v-SEP y la intensidad de mCherry a lo largo del tiempo para dos células representativas cultivadas en un medio que contiene glucosa y aminoácidos (SDC) y obtenidas imágenes cada 2 minutos durante 1000 minutos en cámaras de microfluidos (CellASIC). Las líneas discontinuas indican el momento de aparición de las yemas. d, Las 1.417 trazas de fluorescencia radiométrica de células individuales de v-SEP/mCherry en células cultivadas en dispositivos de microfluidos personalizados en presencia de SDC. Los datos de fluorescencia están alineados con el primer pico de alcalinización del pH vacuolar. e, fotogramas individuales de datos de lapso de tiempo muestran el campo claro y la señal ratiométrica del BCECF vacuolar acumulado. Los valores absolutos de pH se calculan a partir de curvas estándar generadas in situ. Una flecha roja resalta el pico de un evento de alcalinización vacuolar y el cambio en el índice de refracción en el panel de campo claro. f, Cambios absolutos de pH calculados a partir de imágenes radiométricas BCECF trazadas a lo largo del tiempo para dos células representativas. g, pH máximo y pH mínimo observados en 129 eventos del ciclo celular de 27 células diferentes. Los valores medios se indican mediante barras rojas horizontales. h, La diferencia entre los valores de pH máximo y mínimo dentro de 129 eventos discretos del ciclo celular de 27 células. El valor medio se indica con una barra roja horizontal. i, Un modelo esquemático muestra los cambios de pH vacuolar a medida que las células de tipo salvaje (WT) avanzan a lo largo del ciclo celular. En las células no brotadas (izquierda), el pH vacuolar es más ácido y, a medida que las células crecen (derecha), el orgánulo se vuelve menos ácido.

Datos fuente

Utilizamos dispositivos de microfluidos para inmovilizar células completamente prototróficas y tomamos imágenes de v-SEP y mCherry cada 2 minutos durante 1000 minutos (aproximadamente diez divisiones celulares) durante el crecimiento en un ambiente extracelular constante y definido (medio de crecimiento con nutrientes esenciales, aminoácidos y glucosa (SDC )).

Nuestro análisis reveló un aspecto dinámico notable de la regulación del pH vacuolar. Observamos aumentos y disminuciones regulares en la proporción de v-SEP a la fluorescencia de mCherry (Fig. 1c y Video complementario 1) que, cuando se correlacionan con el momento de la aparición de las yemas (Fig. 1c; líneas verticales discontinuas), ocurrieron una vez por ciclo celular. tarde en la mitosis. La fluorescencia de mCherry cambió mínimamente durante el período de obtención de imágenes (Datos ampliados, Fig. 1a) y se observaron resultados idénticos en las imágenes de v-SEP solo (Fig. 1 y vídeo complementario 2). Para cronometrar con mayor precisión los eventos de alcalinización y acidificación dentro del ciclo celular, etiquetamos la membrana plasmática con mRuby2 fusionado a los primeros 28 residuos de la fosfatasa asociada a la membrana plasmática palmitoilada, Psr1 y tomamos imágenes de v-SEP y Psr1-mRuby2 en células en crecimiento. El uso de Psr1-mRuby2 nos permitió cronometrar con precisión el inicio de una nueva hija (Datos extendidos, figura 1b; líneas verticales discontinuas verdes) y la separación de células (Datos extendidos, figura 1b; líneas verticales rojas discontinuas) en relación con los cambios de intensidad de v-SEP (Figura de datos extendidos). .1b; línea negra). Cuantificamos el tiempo a lo largo de 14 eventos del ciclo celular desde la aparición de las yemas hasta la alcalinización vacuolar máxima (59,4 ± 4,6 min) y el tiempo desde la alcalinización vacuolar máxima hasta la separación celular (5,7 ± 1,4 min). Para probar si la progresión del ciclo celular es importante para la dinámica oscilatoria del pH vacuolar, detuvimos las células MATa en G1 con ɑ-factor8 y no observamos oscilaciones después de la detención del ciclo celular (Datos ampliados, Fig. 1c; la línea discontinua roja muestra la separación celular, la línea discontinua azul muestra detención del ciclo celular). Este análisis muestra que la dinámica oscilatoria del pH vacuolar requiere la progresión del ciclo celular y que la alcalinización vacuolar alcanza su punto máximo justo antes de la separación celular en la anafase/telofase tardía.

Para determinar si el dispositivo de microfluidos afectó la dinámica del pH vacuolar, las células se cultivaron en cultivo discontinuo en medio SDC y se dejaron asentar directamente sobre cubreobjetos. Se tomaron imágenes de v-SEP durante aproximadamente 400 minutos o aproximadamente cuatro divisiones celulares. Observamos una dinámica idéntica del reportero v-SEP en estas condiciones (Datos extendidos, figura 1d y video complementario 3), lo que sugiere que el dispositivo de microfluidos no causó el comportamiento oscilatorio. También determinamos si el hacinamiento de células y la privación local de nutrientes en el dispositivo de microfluidos podrían influir en la dinámica del pH vacuolar. Con este fin, utilizamos una plataforma de microfluidos9 hecha a medida en la que las células individuales quedaron atrapadas en captadores de células individuales y las células hijas se lavaron con un flujo de medio constante. Los datos de fluorescencia radiométrica (v-SEP / mCherry) adquiridos durante aproximadamente 1000 minutos se alinearon con el primer evento de alcalinización vacuolar identificado en 1417 células individuales (Fig. 1d). Observamos fuertes oscilaciones bajo este régimen experimental, lo que refuerza la conclusión de que ni el dispositivo de microfluidos ni el hacinamiento celular/la privación de nutrientes influyen en la dinámica del pH vacuolar en nuestros experimentos.

A continuación, examinamos la dinámica del pH vacuolar con dos enfoques independientes adicionales. Primero, aplicamos microscopía de imágenes de vida de fluorescencia resuelta temporalmente (FLIM) para medir los cambios dependientes del pH en la vida de fluorescencia de mScarlet dirigida a vacuolas (v-mScarlet). La vida útil de la fluorescencia de mScarlet es sensible a su pH local, pero insensible a la composición de iones locales y a la concentración de fluoróforos10. Los cambios en la vida útil de la fluorescencia mostraron una dinámica de alcalinización y reacidificación muy similar en la vacuola, como se observó con el reportero v-SEP (datos extendidos, figura 1e y video complementario 4).

En segundo lugar, utilizamos el colorante ratiométrico sensible al pH secuestrado por vacuolas, BCECF4,5. Las células se cultivaron en SDC, se trataron con BCECF en el mismo medio y luego se tomaron imágenes a lo largo del tiempo en el dispositivo de microfluidos utilizando excitación sensible al pH, excitación insensible al pH y campo claro (Fig. 1e y video complementario 5). Este análisis también reveló una dinámica oscilatoria del pH (Fig. 1f). Utilizando una curva de calibración, cuantificamos los cambios de pH en 129 eventos del ciclo celular para 27 células. El pH más bajo a lo largo de los ciclos celulares fue relativamente constante, 5,82 (intervalo de confianza (IC) del 95%: 5,81–5,83) (Fig. 1g; puntos negros), mientras que los eventos de alcalinización máxima en promedio fueron más variables y promediaron el pH 6,20 (IC del 95%). 6.18–6.23) (Fig. 1g; puntos azules). El cambio de pH promedio por ciclo celular fue de 0,38 unidades de pH (IC del 95 %, 0,36 a 0,41) (Fig. 1h).

En conjunto, estos datos sugieren que v-SEP informa con precisión los cambios en el pH vacuolar. Por lo tanto, las vacuolas en las células que crecen en un entorno de crecimiento definido constante que contiene glucosa y aminoácidos, ya sea en cultivo por lotes o en dispositivos de microfluidos, se someten a eventos regulares de alcalinización y acidificación oscilatoria una vez por ciclo celular (Fig. 1i).

El pH de la vacuola responde a los cambios en el ambiente extracelular; por lo tanto, para comparar las oscilaciones del pH vacuolar en poblaciones celulares que crecen en diferentes entornos de crecimiento y con diferentes orígenes genéticos, cuantificamos el período (la frecuencia de alcalinización) y la magnitud de los cambios del pH vacuolar en células individuales que progresan a través de ciclos celulares repetidos. Aplicamos segmentación y seguimiento de características automatizadas para extraer los cambios de intensidad de fluorescencia resueltos temporalmente de v-SEP en vacuolas individuales a medida que pasaban por al menos cinco divisiones celulares. Las trayectorias se transformaron en Fourier para obtener la densidad espectral de potencia (PSD) de los datos de series temporales de células de tipo salvaje cultivadas en SDC (Fig. 2a; trazo superior). En esta situación, la potencia es proporcional a la intensidad de la fluorescencia (amplitud del pH vacuolar oscilatorio) en un dominio de tiempo particular. La frecuencia con mayor potencia indica la frecuencia de oscilación del pH dominante. Calculamos la mediana de las amplitudes en la frecuencia dominante para ~ 300 células que crecen en los dispositivos de microfluidos. Estas células tenían una amplitud de pH vacuolar de 9.900 unidades arbitrarias (AU) (IC del 95%: 9.100 a 11.000) y una periodicidad mediana de 84,9 min (IC del 95%: 84,1 a 85,9, prueba de rangos con signo de Wilcoxon) (Fig. 2b; +AA +glucosa). Estos datos son consistentes con las oscilaciones que ocurren una vez en cada ciclo celular en estas condiciones de crecimiento.

a, Un esquema del proceso PSD para transformar datos de series temporales de intensidad v-SEP de células cultivadas en SDC (arriba) o YNBD (abajo) en gráficos de amplitud versus frecuencia. La amplitud dominante es proporcional a la magnitud de los cambios oscilatorios del pH durante el período de obtención de imágenes (amplitud oscilatoria del pH vacuolar). b, La amplitud del pH vacuolar oscilatorio se obtuvo utilizando la tubería PSD para 339 células cultivadas en SDC (+aminoácidos (AA) +glucosa), 133 células cultivadas en SCEG (+AA, +etanol/glicerol) y 321 células cultivadas en YNBD ( −AA, +glucosa). La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 × los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores de P se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. c, Se tomaron imágenes de células cultivadas en YNBD cada 2 minutos durante 1000 minutos en cámaras de microfluidos (CellASIC). La intensidad de v-SEP a lo largo del tiempo se muestra para dos células representativas. Las líneas discontinuas verticales indican el momento de la aparición de las yemas. d, Amplitud del pH vacuolar oscilatorio de células cultivadas en presencia de adiciones de aminoácidos individuales. La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 × los rangos intercuartílicos, los valores medianos indicados por la barra negra horizontal. Tenga en cuenta que el eje y está fijo en 30.000 AU. Número de células utilizadas en el análisis y periodicidad de las oscilaciones vacuolares del pH en minutos para cada condición: Lys (n = 255, 111 ± 3 min), His (n = 132, 110 ± 5 min), Gly (n = 92, 104 ± 10 min), Pro (n = 26, 82 ± 18 min), Gln (n = 64, 96 ± 11 min), Ser (n = 60, 95 ± 8 min), Glu (n = 90, 87 ± 10 min ), Thr (n = 54, 91 ± 13 min), Arg (n = 280, 110 ± 3 min), Val (n = 56, 106 ± 10 min), Asn (n = 163, 105 ± 3 min), Asp (n = 102, 100 ± 10 min), Ile (n = 420, 98 ± 2 min), Trp (n = 121, 112 ± 4 min), Leu (n = 356, 104 ± 2 min), Ala ( n = 157, 97 ± 3 min), Phe (n = 429, 90 ± 2 min) y Tyr (n = 334, 101 ± 2 min). e, Se tomaron imágenes de células cultivadas en SCEG cada 2 minutos durante 1000 minutos en cámaras de microfluidos (CellASIC). La intensidad de v-SEP a lo largo del tiempo se muestra para dos células representativas. Las líneas discontinuas indican el momento de aparición de las yemas. Consulte los datos de origen para ver curvas adicionales.

Datos fuente

Para determinar si la dinámica oscilatoria del pH era exclusiva de la cepa examinada aquí, se utilizó el proceso de análisis para examinar la dinámica de fluorescencia de v-SEP en dos cepas de laboratorio diferentes, pero comúnmente utilizadas, W303 y BY4741. Descubrimos que ambos tenían una dinámica de pH oscilatoria vinculada al ciclo celular robusta de amplitud y período similares (Datos ampliados, figura 2a).

La vacuola es un integrador central de la disponibilidad nutricional extracelular y un sitio importante de almacenamiento de aminoácidos1. Esto nos llevó a examinar si los aminoácidos extracelulares afectaban la dinámica oscilatoria del pH vacuolar. Para ello, se cultivaron células de tipo salvaje en un medio que contenía glucosa, sales y nutrientes esenciales, pero que carecía de aminoácidos (YNBD). Luego se examinó la dinámica del pH vacuolar con el reportero v-SEP. A diferencia de las células cultivadas en SDC, que proporciona un complemento completo de aminoácidos suministrados exógenamente (Fig. 1c), las células cultivadas en YNBD no experimentaron ciclos de acidificación y alcalinización vacuolar oscilatoria clara y sostenida (Fig. 2c y video complementario 6). En cambio, observamos un aumento lento y progresivo en la intensidad de v-SEP a medida que las células pasaban por divisiones celulares repetidas; se desconoce por qué se produce este aumento. Además, las vacuolas experimentaron pulsos estocásticos de alcalinización y reacidificación que aparentemente no estaban relacionados con ninguna etapa del ciclo celular. La ausencia de una dinámica oscilatoria regular fue respaldada por el análisis PSD (Fig. 2a; trazo inferior), que mostró que cualquier comportamiento oscilatorio de v-SEP estaba marginalmente por encima del fondo para las poblaciones celulares cultivadas en YNBD (Fig. 2b; −AA + glucosa). . Además, estos eventos estocásticos de alcalinización y reacidificación fueron notablemente más rápidos que los observados en COSUDE. La mediana del ancho del pico medio máximo del tiempo pasado en un estado alcalino promedió 2 minutos en YNBD (límite de resolución de tiempo para los experimentos) versus 11 minutos en SDC.

La clara diferencia en la amplitud de la dinámica oscilatoria del pH vacuolar entre las células cultivadas en presencia o ausencia de aminoácidos nos llevó a preguntarnos si algún individuo o clase de aminoácidos contribuía a esta dinámica. Para este fin, las células se cultivaron en YNBD con aminoácidos individuales agregados en concentraciones encontradas en SDC y se evaluó la amplitud de la dinámica oscilatoria de la población celular mediante análisis PSD. Como se informó anteriormente, la cisteína sola provocó que las células crecieran lentamente11,12 y en nuestras manos la metionina recién preparada sola también causó defectos de crecimiento, por lo que se omitieron de análisis posteriores. Para los aminoácidos restantes, observamos una respuesta gradual en la amplitud oscilatoria del pH vacuolar. Algunos, como la lisina, la glicina, la histidina y la prolina apenas pudieron inducir oscilaciones vacuolares del pH (Fig. 2). Por el contrario, los aminoácidos aromáticos tirosina y fenilalanina, los aminoácidos de cadena ramificada leucina y alanina tendieron a inducir oscilaciones vacuolares robustas del pH (Fig. 2), mientras que todos los demás aminoácidos produjeron respuestas intermedias (Fig. 2d).

Durante nuestros experimentos de suplementación con aminoácidos, notamos que algunos aminoácidos, como el triptófano y la glutamina, causaban que las células tuvieran períodos más largos y más cortos de oscilación del pH vacuolar respectivamente, lo que aumenta la posibilidad de que la tasa de crecimiento pueda influir en la magnitud de los cambios del pH vacuolar. Para probar si la tasa de crecimiento celular y los cambios en el período de oscilación del pH vacuolar podrían estar afectando la magnitud de las oscilaciones, trazamos el período de las oscilaciones del pH vacuolar en relación con su magnitud para todas las condiciones de crecimiento y mutantes probados en este manuscrito (descritos a continuación) y encontramos No hay correlación entre los dos parámetros (Datos ampliados, Fig. 2b), lo que sugiere que la tasa de crecimiento no influye en la magnitud de los cambios de pH vacuolar.

Las fuentes de carbono glicolítico y respiratorio son reguladores bien documentados del pH vacuolar13. Por lo tanto, examinamos si la fuente de carbono afecta la dinámica del pH vacuolar durante el ciclo celular. Las células se cultivaron en un medio que contenía todos los aminoácidos y etanol/glicerol (SCEG), una fuente de carbono respiratoria. Hubo un aumento de ~1,8 veces en la amplitud del pH vacuolar oscilatorio, a nivel de población (18.000 AU, IC del 95 %: 14.000 a 22.000, n = 133 células), en relación con las células cultivadas en glucosa (Fig. 2b; comparar +AA +etanol/glicerol a +AA +glucosa y vídeo complementario 7). Los trazos de intensidad de v-SEP individuales mostraron oscilaciones ligadas al ciclo celular fácilmente identificables con mayor amplitud y mayor intensidad basal en relación con las células cultivadas en presencia de glucosa (Fig. 2e; compare las curvas representativas en la Fig. 1 (v-SEP.SDC) con Fig. 2 (v-SEP.SCEG)). Esto es consistente con los datos que sugieren que la disponibilidad de fuentes de carbono glicolítico es un regulador importante del pH vacuolar13.

En conjunto, estos datos sugieren que la amplitud de las oscilaciones del pH vacuolar está modulada por la disponibilidad de aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada y la capacidad fermentativa o respiratoria de la fuente de carbono suministrada.

Para identificar vías celulares que podrían estar detectando y respondiendo al aumento de aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada extracelular, analizamos la firma transcripcional de células cultivadas en presencia de tirosina o leucina mediante RNA-seq. Como se demostró previamente14, las células respondieron a los aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada extracelulares regulando positivamente la expresión de permeasas de aminoácidos a través de la acción de la respuesta SPS (Datos ampliados, figura 3a). La respuesta SPS es impulsada por un módulo sensor en la membrana plasmática compuesto por Ssy1, Ptr3 y Ssy5, que activa dos factores de transcripción, Stp1 y Stp215. La respuesta SPS induce la síntesis de diez permeasas de aminoácidos que impulsan la importación de aminoácidos al interior de la célula16. Para probar el papel de la respuesta SPS y la importación de aminoácidos en la regulación del pH vacuolar, cuantificamos la amplitud oscilatoria del pH vacuolar en células que carecen de componentes de respuesta SPS cultivadas en SDC (Fig. 3a). En cada mutante, observamos una reducción> dos veces en la amplitud del pH vacuolar oscilatorio en relación con las células de tipo salvaje (Fig. 3a). Estos datos sugieren que el aumento de aminoácidos intracelulares que resulta de la respuesta SPS es importante para estimular la dinámica oscilatoria del pH en la vacuola.

a, Amplitud del pH vacuolar oscilatorio de células de tipo salvaje y células que carecen de los componentes SPS, Ptr3 (288 células), Ssy1 (447 células) y Ssy5 (399 células), cultivadas en SDC. La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 × los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores de P se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. b, Se tomaron imágenes de células cultivadas en SDC cada 2 min durante 1000 min en cámaras de microfluidos (CellASIC) y se trataron en el dispositivo con rapamicina (barra roja vertical). La intensidad de v-SEP a lo largo del tiempo se muestra para dos células representativas. c, Se tomaron imágenes de células cultivadas en SDC cada 2 min durante 1000 min en cámaras de microfluidos (CellASIC) y se trataron en el dispositivo con ConcA (barra roja vertical). La intensidad de v-SEP a lo largo del tiempo se muestra para dos células representativas. Las líneas discontinuas indican el momento de aparición de las yemas. d, Amplitud del pH vacuolar oscilatorio de células WT y células que carecen de los componentes Fab1, Vac7 (177 células), Vac14 (287 células), Atg18 (200 células), Fab1 (21 células) y Fig4 (206 células), cultivadas en SDC. La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 × los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores de P se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. e, amplitud oscilatoria del pH vacuolar de células de tipo salvaje y células que carecen del homólogo de CDK5 Pho85 (201 células) y las ciclinas asociadas Pho80 (240 células), Pcl6 (315 células), Pcl7 (277 células) y el doble mutante Pcl6 y Pcl7 ( 206 celdas). Las células se cultivaron en SDC. La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 × los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores de P se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. f, Amplitud oscilatoria del pH vacuolar de células WT y células que carecen de siete fosfositios putativos Pho85 en Vac7 (vac7-7A, 228 células) y 21 fosfositios putativos en Fab1 (fab1-21A, 168 células) y el doble mutante (vac7 -7A fab1-21A, 257 células). Las células se cultivaron en SDC. La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 × los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores de P se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. Consulte los datos de origen para ver curvas adicionales.

Datos fuente

Para identificar un vínculo molecular entre los cambios en la disponibilidad de aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada citoplasmática y la amplitud oscilatoria del pH vacuolar, probamos la contribución a la inducción de oscilaciones del pH vacuolar por las dos principales vías de detección de aminoácidos citoplasmáticos: control general de aminoácidos y TORC115,17. Si bien la eliminación de la eIF2-quinasa, GCN2, no afectó la dinámica del pH de la vacuola oscilatoria (Datos ampliados, Fig. 3b), la inhibición farmacológica de la señalización de TORC1 mediante el tratamiento de las células con rapamicina tuvo un fuerte efecto (Fig. 3b; el momento de la adición de rapamicina está marcado por línea vertical roja; Video complementario 8).

La señalización de TORC1 integra el estado nutricional celular con el almacenamiento de metabolitos de vacuola/lisosoma a través de la función v-ATPasa en células de levadura y mamíferos2. Además, la v-ATPasa es el principal regulador del pH vacuolar. Por lo tanto, probamos la contribución de la v-ATPasa a la dinámica oscilatoria del pH vacuolar eliminando genéticamente la subunidad V0 específica de la vacuola de la v-ATPasa, Vph1. Descubrimos, como se informó anteriormente, que las células que carecen de Vph1 tienen vacuolas altamente fragmentadas18; Estas vacuolas altamente fragmentadas en las células vph1∆ eran excepcionalmente móviles y demasiado difíciles de rastrear y cuantificar con precisión en el transcurso de muchas horas. Para sortear este desafío, probamos la función directa de la v-ATPasa mediante el tratamiento de las células con el inhibidor farmacológico de la v-ATPasa, concanamicina A (ConcA). Después de cambiar a un medio de crecimiento que contiene el inhibidor de v-ATPasa (Fig. 3c, sincronización de la adición de ConcA marcada por una línea vertical roja y video complementario 9), la intensidad de fluorescencia de v-SEP aumentó progresivamente, lo que indica alcalinización vacuolar y pérdida de la dinámica oscilatoria del pH. . En particular, el aumento de la fluorescencia del indicador v-SEP precedió a la fragmentación observada en las células vph1∆, lo que permitió un seguimiento y una cuantificación precisos de los cambios de fluorescencia de v-SEP. En conjunto, estos datos sugieren que la v-ATPasa es un importante facilitador de las oscilaciones del pH de las vacuolas ligadas al ciclo celular.

Para explorar las entradas que pueden acoplar la regulación de la actividad v-ATPasa y TORC1, examinamos el papel del lípido PtdIns(3,5)P2 específico de vacuola para contribuir a la dinámica oscilatoria del pH vacuolar. PtdIns(3,5)P2 es un lípido fosfoinositol minoritario de la vacuola que responde al estrés. Es producido por el complejo quinasa Fab1 (PIKfyve en mamíferos), que contiene Fab1, Vac7, Vac14 y está regulado negativamente por Fig4 y Atg1819. PtdIns(3,5)P2 interactúa y estabiliza la holoenzima v-ATPasa en células osmóticamente estresadas y desempeña un papel en la regulación de la señalización de TORC1 durante el estrés nutricional19. El complejo Fab1 también está regulado recíprocamente por TORC120, lo que hace que la producción de PtdIns(3,5)P2 sea una encrucijada regulatoria potencialmente importante para coordinar la dinámica del pH vacuolar y la detección de aminoácidos. Si bien se ha sugerido que el complejo Fab1 no afecta el pH vacuolar en células no estresadas de rápido crecimiento21, la dinámica de la regulación del pH no se ha examinado en mutantes Fab1 a nivel de una sola célula. La eliminación genética de Vac7, Vac14, Atg18 y Fab1 tuvo un fuerte efecto sobre la amplitud de la dinámica oscilatoria del pH en presencia de aminoácidos extracelulares en relación con las células de tipo salvaje (Fig. 3d). Es de destacar que la eliminación de Fig4, una fosfatasa propuesta para actuar como un regulador importante del complejo22, tenía una amplitud de pH vacuolar oscilatorio ligeramente mayor en relación con las células de tipo salvaje en SDC (Fig. 3d). Estos datos sugieren que la producción de PtdIns (3,5) P2 es esencial para modular la dinámica oscilatoria del pH vacuolar y que la regulación del complejo Fab1 por la Fig4 no es estrictamente necesaria, pero desempeña un papel regulador más matizado.

a, Fotogramas individuales de imágenes en intervalos de tiempo de mCherry-Atg18 y v-SEP durante una ronda de alcalinización vacuolar resaltadas con líneas discontinuas en el siguiente gráfico de series temporales. El gráfico de serie temporal inferior muestra la intensidad de mCherry-Atg18 en la superficie vacuolar y la intensidad lumenal de v-SEP durante múltiples eventos de división celular. Las señales máximas de v-SEP se resaltan con una línea gris continua. b, Un modelo muestra los actores moleculares involucrados en la regulación del pH vacuolar a medida que las células WT crecen en presencia de alanina, aminoácidos de cadena ramificada y aromáticos. La regulación del pH requiere la estimulación dependiente de Pho85/Pcl6/Pcl7 del complejo Fab1 (PIKfyve en mamíferos) para producir PtdIns(3,5)P2 (PI(3,5)P2), que recluta Atg18 y activa recíprocamente TORC1 y v- ATPasa. Durante el crecimiento, los niveles de PtdIns(3,5)P2 en la vacuola disminuyen, lo que a su vez puede regular negativamente tanto TORC1 como v-ATPasa, lo que lleva a un aumento en el pH vacuolar. Consulte los datos de origen para ver curvas adicionales.

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La producción de PtdIns (3,5) P2 durante el estrés osmótico está relacionada con la señalización de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) a través de la actividad del par de ciclina CDK sensible a nutrientes Pho85-Pho8019. Pho85-Pho80 fosforila directamente el complejo Fab1 y regula positivamente su actividad19. Para probar si la señalización de CDK influye en la dinámica oscilatoria del pH vacuolar, cuantificamos la amplitud de las oscilaciones del pH en células que carecen de Pho85 y Pho80. Las células pho85∆ tenían oscilaciones fuertemente reducidas, mientras que las oscilaciones en las células pho80∆ no se redujeron sustancialmente (Fig. 3e) en relación con las células de tipo salvaje (Fig. 3e), lo que sugiere que, similar al ejemplo de la Fig.4 anterior para el complejo Fab1, Los aspectos de la regulación de PtdIns (3,5) P2 durante el crecimiento celular sin estrés son diferentes a los del estrés osmótico. Pho85 tiene diez socios ciclina (Pho80, Clg1, Pcl1, Pcl2, Pcl5, Pcl6, Pcl7, Pcl8, Pcl9 y Pcl10) que están compuestos por pares parálogos de ciclinas con funciones redundantes23. Encontramos que Pcl6 y Pcl7 contribuyeron cada uno a las oscilaciones del pH vacuolar (Fig. 3e). La eliminación de Pcl6 y Pcl7 (Fig. 3e) redujo aún más la amplitud de la dinámica oscilatoria del pH vacuolar a la observada en las células pho85∆.

Se propone que Pho85 fosforile Fab1 y Vac7 para regular su actividad19. Para probar la importancia de la fosforilación dependiente de Pho85 de Fab1 y Vac7 para la dinámica del pH vacuolar, cuantificamos la amplitud de las oscilaciones de pH en mutantes previamente descritos de Fab1 que carecen de 21 putativos fosfo-sitos Pho85 (fab1-21A) y Vac7 que carecen de 7 putativos fosfo Pho85. -sitios (vac7-7A)19. Las células mutantes Vac7-7A tenían oscilaciones de pH vacuolar ligeramente reducidas, mientras que las células mutantes fab1-21A tenían un déficit más fuerte (Fig. 3f). El doble mutante redujo aún más la amplitud del pH vacuolar oscilatorio a la observada en las células pcl6∆pcl7∆ y pho85∆ (Fig. 3f).

En conjunto, estos datos sugieren que Pcl6 y Pcl7 son dos ciclinas que actúan de forma redundante a través de la quinasa Pho85 para regular la dinámica del pH vacuolar oscilatorio ligado al ciclo celular, muy probablemente mediante la fosforilación de Fab1 y Vac7.

Hasta ahora, los datos sugieren un modelo en el que los cambios dependientes de Pho85/Pcl6/Pcl7 en la actividad de Fab1 alteran los niveles de PtdIns(3,5)P2 para afectar la actividad de v-ATPasa y la función de TORC1. Sin embargo, hasta la fecha, no hay indicios de que los niveles de PtdIns(3,5)P2 en la vacuola estén cambiando durante el crecimiento celular para implementar dicho control regulatorio durante el ciclo celular. Medir PtdIns(3,5)P2 en células no estresadas es un desafío debido a su baja abundancia en relación con el conjunto total de fosfoinositol. Además, existe evidencia de que la producción de PtdIns(3,5)P2 está regulada de manera diferencial entre los endosomas de señalización y la vacuola20, lo que hace que las técnicas que miden los niveles celulares totales de PtdIns(3,5)P2 sean inapropiadas para capturar la dinámica de este lípido específicamente en el nivel celular. vacuola. Atg18 es un componente regulador importante de la generación de PtdIns(3,5)P2 y se propone que sea una proteína detectora de PtdIns(3,5)P2. También es un regulador negativo del complejo Fab1. Para explorar la acumulación de PtdIns (3,5) P2 en la vacuola, monitoreamos la dinámica de Atg18 junto con el reportero v-SEP. mCherry-Atg18 marcado en el extremo N-terminal mostró una clara localización de la membrana limitante vacuolar en células con vacuolas ácidas (Fig. 4a, arriba a la izquierda y video complementario 10); sin embargo, a medida que las vacuolas se volvieron menos ácidas, mCherry-Atg18 se desplazó de la membrana y luego se volvió a ensamblar en la superficie vacuolar a medida que se restableció la acidez (Fig. 4a, parte superior central y derecha, y video complementario 10). La cuantificación de mCherry-Atg18 en la superficie vacuolar en relación con la fluorescencia de v-SEP muestra que Atg18 sufre rondas de reclutamiento y desplazamiento desde la superficie vacuolar que están estrictamente ligadas a rondas de acidificación y alcalinización, respectivamente (Fig. 4a, gráfico inferior y extendido). Datos Fig. 3c). La actividad y el ensamblaje de v-ATPasa están influenciados por PtdIns(3,5)P2. Para probar si el ciclo de los niveles de PtdIns (3,5) P2 en células no estresadas afecta el estado de ensamblaje de v-ATPasa, etiquetamos una subunidad del dominio V1 periférico (Vma5) y examinamos su localización durante un ciclo celular junto con el reportero v-SEP. No encontramos evidencia de que el dominio V1 de la v-ATPasa esté regulado en el nivel de ensamblaje en la superficie vacuolar (Datos ampliados, figura 3d). En conjunto, estos datos sugieren que los niveles de PtdIns(3,5)P2 están ciclando a lo largo del ciclo celular y proporcionan evidencia de que la regulación dependiente de PtdIns(3,5)P2 de la v-ATPasa está actuando más allá del nivel de estado de ensamblaje/estrés osmótico. y puede desempeñar un papel en la regulación del pH vacuolar durante el crecimiento vegetativo en células no estresadas (resumido en la Fig. 4b).

Se propone que el pH vacuolar ácido sea esencial para el almacenamiento de metabolitos como los aminoácidos1. Nos preguntamos si la alcalinización y acidificación dinámica dependiente de CDK y PtdIns (3,5) P2 del compartimento vacuolar era suficiente para alterar las concentraciones de metabolitos vacuolares durante el crecimiento celular. Con este fin, seguimos el destino del análogo del triptófano, 4-cianotriptófano (4cnTrp) dentro de las células24. El 4cnTrp se diferencia del triptófano en dos átomos, se excita con luz de 355 nm, tiene un alto rendimiento cuántico y su intensidad de fluorescencia es insensible a los cambios de pH biológicamente relevantes25, lo que lo hace ideal para nuestros propósitos.

Primero verificamos que 4cnTrp, sintetizado por una variante diseñada de TrpB de Thermotoga maritima26, no mostró cambios de fluorescencia en los rangos de pH de 5,5 a 7,0 (Datos ampliados, figura 4). Luego agregamos 4cnTrp a las células como única fuente de aminoácidos extracelular. Las imágenes de 4cnTrp y v-SEP mostraron que 4cnTrp se acumuló en la vacuola y estimuló las oscilaciones del pH vacuolar tal como lo hizo el triptófano (Fig. 5a, b, micrografías y gráficos: pre-ConcA y video complementario 11). En particular, la acumulación de 4cnTrp en la vacuola fue oscilatoria y aumentó cuando el pH vacuolar era más ácido (Fig. 5b, pre-ConcA). Esto era consistente con la idea de que el pH vacuolar era esencial para la acumulación de metabolitos vacuolares. Para probar si el pH vacuolar era el principal determinante de la acumulación y retención de 4cnTrp en la vacuola, tratamos las células con el inhibidor de v-ATPasa, ConcA, mientras obteníamos imágenes de v-SEP y 4cnTrp. La inhibición de la v-ATPasa provocó la rápida salida de 4cnTrp de la vacuola, lo que concuerda con la alcalinización del orgánulo (Fig. 5a, b, micrografías y gráficos: post-ConcA).

a, Fotogramas individuales de imágenes de lapso de tiempo de 4cnTrp y v-SEP antes del tratamiento con ConcA (pre-ConcA) y después de la adición de ConcA (post-ConcA). b, La intensidad de fluorescencia de Vacuolar v-SEP y 4cnTrp a lo largo del tiempo se representa en verde y cian, respectivamente. La línea roja vertical indica el momento de la adición de ConcA. Tenga en cuenta que la intensidad de v-SEP en este gráfico no es comparable a los otros datos de intensidad de v-SEP del resto del manuscrito, ya que se generó en un microscopio confocal usando diferentes tiempos de exposición y una cámara diferente (Métodos). Consulte los datos de origen para ver curvas adicionales.

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Durante nuestra caracterización de los cambios de pH vacuolar, notamos que hubo un cambio distintivo en el índice de refracción y la tonicidad aparente de la vacuola que ocurrió simultáneamente con el pico de alcalinización vacuolar (Fig. 1e, flecha roja y video complementario 5). Esto sugiere una alteración de la concentración de soluto dentro de la vacuola27 y puede indicar un intercambio de solutos entre el citoplasma y la vacuola que se combina con alteraciones del pH vacuolar. En conjunto, estos datos sugieren que la dinámica del pH vacuolar es de magnitud suficiente para sacar los metabolitos de la vacuola y que el gradiente de pH vacuolar puede estar actuando como un reóstato molecular que controla las concentraciones de muchos metabolitos almacenados en la vacuola.

Para comprender mejor la importancia biológica de la dinámica oscilatoria del pH vacuolar y la liberación de metabolitos, buscamos identificar un perfil fenotípico común entre los mutantes que carecían de oscilaciones del pH vacuolar. Todos los mutantes de oscilación vacuolar fuerte del pH tienen defectos pronunciados en el crecimiento celular, excepto atg18∆, el regulador de la dinámica de PtdIns(3,5)P2 asociado con el complejo Fab1. Para evitar la pleiotropía potencial debido a los déficits de crecimiento y limitar las consecuencias fenotípicas del bloqueo de las oscilaciones del pH vacuolar, realizamos RNA-seq para comparar los transcriptomas de tres cepas que no pueden oscilar el pH de la vacuola, cada una de las cuales tiene diferentes efectos en la fisiología celular. Utilizamos cepas con una única deleción de la lípido quinasa Fab1 (fab1∆), el regulador negativo del complejo Fab1 (atg18∆) y la subunidad vacuolar específica de la v-ATPasa (vph1∆). Realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para identificar vías bioquímicas compartidas reguladas hacia arriba y hacia abajo e identificamos cinco vías KEGG significativas con regulación positiva y dos con regulación negativa compartidas entre las cepas atg18∆, fab1∆ y vph1∆ (Fig. 6a). Los genes implicados en las vías co-reguladas a la baja consistían en dos clases, la fosforilación oxidativa y el ribosoma. La regulación negativa de la fosforilación oxidativa es consistente con informes anteriores que relacionan la v-ATPasa y el complejo Fab1 con la función mitocondrial29. La regulación negativa de los genes de las proteínas ribosómicas sugirió que las células incapaces de oscilar el pH vacuolar estaban experimentando estrés proteotóxico30 y una capacidad de traducción reducida31.

a, Diagramas de Venn de vías KEGG compartidas con regulación positiva (naranja) y regulación negativa (azul) identificadas mediante análisis GSEA que comparan los transcriptomas de fab1∆, atg18∆ y vph1∆. Las vías de KEGG se muestran en formato tabular con valores de P y puntuaciones de enriquecimiento normalizadas (NES) para cada mutante. b, Gráficos de volcán de cambios transcripcionales en células atg18∆, vph1∆ y fab1∆ en comparación con células de tipo salvaje. Los genes expresados ​​diferencialmente, valor q > 0,05, están coloreados en rojo y Arg1 está resaltado en verde. c, Histogramas de la expresión de Arg1-mNeon analizados mediante citometría de flujo que comparan los niveles de Arg1 en células de tipo salvaje y atg18∆ en un medio que contiene aminoácidos (izquierda, SDC, WT \(\underline{x}\) = 496,4 AU versus atg18∆ \ (\underline{x}\) = 901,0 AU, prueba t bilateral P < 2,2 × 10−16) y sin aminoácidos (derecha, YNBD, WT \(\underline{x}\) = 3235,1 AU versus atg18 ∆ \(\underline{x}\) = 3520,6 AU, prueba t bilateral P < 2,2 × 10−16). d, gráfico de la amplitud oscilatoria del pH vacuolar de un solo aminoácido (de la Fig. 2d) versus la inducción de Arg1-mNeon en células atg18∆ en relación con WT. Las barras de error representan IC del 95%.

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Un examen de los genes regulados al alza sugirió que se indujeron varias vías bioquímicas relacionadas con la producción de metabolitos (Fig. 6a). En primer lugar, la regulación positiva de los genes del metabolismo del almidón y la sacarosa fue impulsada en gran medida por genes implicados en el metabolismo del glucógeno, cuya transcripción está controlada por la disponibilidad de fuentes de carbono y nitrógeno32. Las últimas cuatro clases de vías KEGG con regulación positiva se centraron en el metabolismo del nitrógeno, y los genes ARG1 y ARG3 proporcionaron una contribución importante a cada clase enriquecida. El análisis de expresión diferencial destacó los cambios transcripcionales globales relativamente modestos en atg18∆ en relación con fab1∆ y vph1∆, pero muestra que Arg1 fue uno de los genes regulados positivamente más significativamente en los tres mutantes de deleción (Fig. 6b). En conjunto, estos datos sugieren que uno de los fenotipos compartidos por las células incapaces de oscilar el pH vacuolar es un desequilibrio percibido de nitrógeno y la regulación positiva de los genes biosintéticos de arginina.

Atg18 es un componente importante de la maquinaria autofágica que, junto con Atg2, tiene un papel clave en la expansión del autofagosoma33. Nos preguntamos si la autofagia defectuosa podría estar desempeñando un papel en la regulación positiva de ARG1 y ARG3 en células atg18∆. Para explorar esto, volvimos a analizar los datos de expresión de ARN mensajero publicados previamente de 1.484 cepas de levadura knockout34 y extrajimos los cambios en los pliegues del ARNm en cepas knockout de autofagia en relación con las células de tipo salvaje, centrándonos en los cambios transcripcionales en los genes biosintéticos de arginina. Estos datos no muestran cambios significativos en el ARNm de ARG1 o ARG3 en 23 cepas que carecen de componentes clave del proceso de autofagia (Datos ampliados, Fig. 5a), lo que sugiere que las células atg18∆ regulan positivamente ARG1 y ARG3, lo cual es independiente de los defectos en la autofagia.

La vía biosintética de la arginina se caracteriza por la regulación directa por parte de la arginina a nivel enzimático, a nivel transcripcional y a nivel traduccional35. Los primeros cinco pasos de la biosíntesis de arginina tienen lugar en la mitocondria, mientras que los tres últimos pasos, catalizados por Arg1, Arg3 y Arg4, tienen lugar en el citoplasma. El papel central de la arginina en el metabolismo del nitrógeno, su fuerte acumulación en la vacuola y la regulación positiva de los actores citoplasmáticos clave en la biosíntesis de la arginina nos llevaron a preguntarnos si las oscilaciones del pH vacuolar son importantes para suministrar arginina al citoplasma en condiciones de exceso de alanina, aromáticas o ramificadas. aminoácidos de cadena. Para ver si la inducción transcripcional de estas enzimas citoplasmáticas clave se recapituló a nivel de proteína, etiquetamos ARG1 y ARG3 con mNeon. En particular, se analizaron las células atg18∆ debido a su fenotipo de crecimiento relativamente benigno. Encontramos que, de hecho, Arg1 estaba regulado positivamente ~ 1,8 veces en células atg18∆ cultivadas en condiciones donde normalmente se inducían oscilaciones de pH vacuolar (Fig. 6c, SDC). También se observó una regulación positiva similar, pero menos pronunciada (1,3 veces), de Arg3 (Datos ampliados, figura 5b). En el medio que carece de aminoácidos (YNBD), donde Arg1 ya está altamente expresado, solo hubo una ligera regulación positiva (1,1 veces) de Arg1 en células atg18∆ en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. 6c).

Luego preguntamos si la regulación positiva de Arg1 en atg18∆ fue inducida por aminoácidos particulares. Descubrimos que, para cada aminoácido agregado, la magnitud de la inducción de Arg1 en atg18∆ en relación con las células de tipo salvaje se correlacionaba con la correspondiente amplitud oscilatoria del pH vacuolar. Este análisis reveló una clara correlación en la que la alanina, los aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada produjeron individualmente la inducción más fuerte de Arg1 (Fig. 6d), mientras que juntos todos los aminoácidos (SDC) producen la inducción máxima. Esto sugiere que los aminoácidos que inducen la expresión de Arg1 en atg18∆ son los mismos que inducen oscilaciones vacuolares del pH y que existe un efecto aditivo de todos los aminoácidos en la inducción de Arg1.

A partir de estos resultados, proponemos que las células están utilizando oscilaciones de pH vacuolar para ajustar su capacidad biosintética de arginina en respuesta a cambios en la disponibilidad de alanina citoplasmática, aminoácidos de cadena ramificada y aromáticos. Cuando se enfrentan a la incapacidad de acceder a una reserva vacuolar de arginina, las células regulan negativamente las proteínas ribosómicas, reducen su función mitocondrial e intentan regular positivamente la biosíntesis de arginina citoplasmática.

La evidencia emergente sugiere que los cambios dinámicos en los niveles de aminoácidos respaldan cambios en la capacidad de síntesis de proteínas a medida que las células transitan por el ciclo celular36,37. Dado esto, la aparente coordinación de la biosíntesis de arginina con la disponibilidad de alanina, aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada (Fig. 6d) y nuestra observación de que la vacuola es más alcalina justo antes de la división celular (Fig. 1c y Datos ampliados Fig. 1b), nos llevó a preguntar si las oscilaciones del pH vacuolar impactan aspectos de la regulación del ciclo celular. Específicamente, examinamos la coordinación bien establecida del tamaño de nacimiento de la célula y el tiempo que le toma a esa célula recién nacida comprometerse con un evento de replicación del ADN38,39. Esto se probó determinando si las células mutantes que carecen de la capacidad de liberar aminoácidos de la vacuola durante el ciclo celular tienen defectos en estos eventos coordinados.

Para medir el tamaño celular, etiquetamos la membrana plasmática con mRuby2 fusionado a los primeros 28 residuos de la fosfatasa asociada a la membrana plasmática palmitoilada, Psr1. Para minimizar la fototoxicidad durante el período de obtención de imágenes, utilizamos un microscopio de hoja de luz de un solo objetivo hecho a medida40 para capturar datos volumétricos completos a medida que las células crecían exponencialmente en SDC. Cuantificamos el volumen de la célula hija cuando se separó de su madre y el crecimiento que experimentó la hija antes de iniciar la formación de una nueva yema (duración relativa de G1). La duración escalada de G1 se correlacionó negativamente con el tamaño de la célula al nacer en células de tipo salvaje (Fig. 7a, círculos azules y video complementario 12; pendiente ~ −1.0, P = <1 × 10−4). Por lo tanto, como se describió anteriormente39, la transición de G1 a S en estas células de levadura de tipo salvaje operó bajo un régimen de control de tamaño; sin embargo, en las células atg18∆ hubo una falla en el control de tamaño (Fig. 7a, triángulos rojos y video complementario 13; pendiente ~ −0,2, P = 0,49). Es decir, la pendiente de la duración escalada de G1 versus el tamaño celular transformado logarítmicamente al nacer fue ~−0,2 en atg18∆ en lugar de ~−1,0 como se observa en las células de tipo salvaje (P = 2,3 × 10−2, prueba F, pendiente de tipo salvaje versus atg18∆). Esto sugiere que el control adecuado del tamaño en la levadura depende, al menos en parte, de la coordinación regulada por el ciclo celular de las reservas de aminoácidos generadas por el control dinámico del pH vacuolar.

a, Gráfico de crecimiento relativo en G1 versus ln (tamaño al nacer) en tipo salvaje (círculos azules) y atg18∆ (triángulos rojos). La pendiente de la regresión lineal se indica para cada deformación en el recuadro. b, Un modelo esquemático muestra la regulación del pH vacuolar a medida que las células WT crecen en presencia de alanina, aminoácidos de cadena ramificada y aromáticos (AA). En las células no brotadas (izquierda), el pH vacuolar es más ácido, lo que impulsa la acumulación de aminoácidos en la luz del orgánulo. A medida que las células crecen (derecha), el orgánulo se vuelve menos ácido y libera aminoácidos en el citoplasma. La regulación del pH requiere la estimulación dependiente de Pho85/Pcl6/Pcl7 del complejo Fab1 para producir PtdIns(3,5)P2, que recluta Atg18 y activa recíprocamente TORC1 y la v-ATPasa. Durante el crecimiento, los niveles de PtdIns(3,5)P2 en la vacuola disminuyen, lo que a su vez regula negativamente tanto TORC1 como v-ATPasa, lo que conduce a un aumento en el pH vacuolar y la salida de aminoácidos almacenados en la vacuolar. Las células mutantes incapaces de oscilar el pH vacuolar durante el crecimiento (abajo) regulan negativamente los genes ribosómicos y mitocondriales y regulan positivamente la biosíntesis de arginina para intentar mantener la homeostasis. Estos eventos conducen a una coordinación desregulada del tamaño celular y el momento para el inicio de la replicación del ADN. ox-fos, fosforilación oxidativa.

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Los microorganismos y muchos tipos de células de metazoos están preparados para absorber nutrientes cuando están disponibles y coordinarlos con un crecimiento rápido. Como resultado, los mecanismos homeostáticos han evolucionado para mantener niveles apropiados de metabolitos celulares a pesar de enfrentarse a una disponibilidad fluctuante de nutrientes y/o demanda celular (por ejemplo, crecimiento y secreción de proteínas). Trabajos recientes en cultivos de tejidos con células de mamíferos41 identificaron que la absorción y el almacenamiento de aminoácidos dentro de los lisosomas durante condiciones de abundancia de nutrientes era fundamental para apoyar la traducción durante la falta de nutrientes; sin embargo, no está tan claro si la compartimentación de aminoácidos en células en crecimiento activo es importante42.

El presente estudio revela una capa nueva e inesperada de regulación del pH vacuolar y la homeostasis de los aminoácidos en células en crecimiento no estresadas. Encontramos que las células que crecen en presencia de alanina, aminoácidos de cadena ramificada o aromáticos se someten a eventos regulares de alcalinización y reacidificación vacuolar una vez por ciclo celular (Fig. 7b). Proponemos que las células poseen mecanismos de detección de aminoácidos citoplasmáticos que integran diversas señales metabólicas intra y extracelulares (fuente de carbono glicolítica versus fuente de carbono respiratoria y tipo de aminoácido; ver Fig. 2) para secuestrar y luego movilizar aminoácidos a través de la modulación dinámica del pH vacuolar en un intento de mantener la homeostasis de los aminoácidos durante el crecimiento celular. De acuerdo con el papel del metabolismo de la fuente de carbono en la homeostasis de los aminoácidos, se ha informado que la represión de los catabolitos de carbono está funcionalmente entrelazada con el metabolismo de los aminoácidos a través de la señalización TORC143.

Nuestros datos sugieren que las células utilizan reservas internas de aminoácidos almacenados como amortiguador para respaldar múltiples sistemas celulares, incluida la traducción, la función mitocondrial y el tamaño celular. Proponemos que si las células no pueden regular dinámicamente el pH vacuolar en presencia de ciertos aminoácidos extracelulares, es posible que no puedan liberar grupos vacuolares de aminoácidos como la arginina. Este déficit conduce a una capacidad de traducción reducida a través de la regulación negativa de los niveles de transcripción ribosómica, una función mitocondrial reducida al regular negativamente los genes de fosforilación oxidativa (Fig. 6a) y, en consecuencia, una coordinación desregulada del tamaño celular y el tiempo de G1 (ver Fig. 7a). El mantenimiento de la capacidad de traducción y/o la función mitocondrial durante el crecimiento celular puede afectar la traducción de proteínas reguladoras clave del ciclo celular, como el importante regulador de la transición de G1 a S, Cln3, o mediante la regulación de otros pasos del ciclo celular que detectan el metabolito. /niveles de aminoácidos de la célula44,45,46.

Además, el secuestro de aminoácidos en la vacuola puede ser importante de otra manera para la homeostasis celular: prevención del desequilibrio de aminoácidos durante la abundancia de nutrientes en el medio ambiente. Estos desequilibrios pueden afectar a varios procesos celulares. Los desequilibrios de aminoácidos pueden provocar una carga errónea del ARN de transferencia y, en consecuencia, una traducción errónea47. Además, la concentración de aminoácidos y la optimización de codones son una fuente importante de estabilidad del ARNm48. Los desequilibrios de aminoácidos también pueden alterar el flujo a través de las vías anabólicas debido a la inhibición de retroalimentación35. Recientemente se demostró que el exceso de cisteína en el citoplasma conduce al colapso de la biogénesis del grupo hierro-azufre y a la salud mitocondrial durante el proceso de envejecimiento4.

Es probable que el mecanismo detallado de cómo se pierde y luego se recupera la acidez vacuolar durante el crecimiento celular sea mecanísticamente complejo. Nuestros datos muestran un papel de la generación de v-ATPasa, TORC1, Pho85 (o CDK5) y PtdIns (3,5) P2 en la regulación de la dinámica del pH vacuolar durante el ciclo celular (Fig. 7b). Nuestra observación de que la proteína de unión PtdIns(3,5)P2 y reguladora del complejo Fab1, Atg18, se recluta dinámicamente en la membrana limitante vacuolar sugiere que la especie lipídica reguladora clave PtdIns(3,5)P2 puede estar oscilando en las células en crecimiento. (Figura 4a). Si bien comprometer el complejo central de quinasa Fab1 conduce a niveles más bajos de PtdIns (3,5) P2 y comprometer la función Atg18 conduce a niveles más altos de PtdIns (3,5) P2, ambas perturbaciones individuales bloquean las oscilaciones del pH vacuolar. Esto sugiere que el ciclo apropiado de PtdIns(3,5)P2 es esencial para coordinar diferentes fases de acidificación y alcalinización vacuolar, aunque también es posible que Atg18 pueda estar desempeñando un papel más directo en la regulación de la liberación de aminoácidos de la vacuola. La importancia de PtdIns (3,5) P2 en la regulación de la v-ATPasa y TORC1 y el papel de la CDK Pho85 sensible a los nutrientes para modular la actividad de Fab1 sugiere que existe una rica red reguladora que requerirá una mayor disección mecanicista. Además, el hecho de que todas estas vías biológicas estén altamente conservadas plantea la posibilidad de que el pH lisosomal y la movilización de metabolitos lisosómicos puedan regularse dinámicamente en otros eucariotas. En particular, esperamos que esta dinámica sea importante en condiciones donde una mayor demanda de síntesis de proteínas u otros aspectos del metabolismo celular proporciona una ventaja para el rápido crecimiento celular, como la embriogénesis, el cáncer y la activación de células madre inactivas.

Trabajos recientes sugieren que las vías biosintéticas de aminoácidos están optimizadas para etapas particulares del ciclo celular para respaldar la traducción de proteínas con composiciones de aminoácidos sesgadas37. Proponemos que la levadura también esté utilizando la regulación vacuolar del pH y la movilización de aminoácidos para aumentar estos intentos de mantener la capacidad de traducción durante el ciclo celular (Fig. 7b). Sorprendentemente, nuestros resultados sugieren que la incapacidad de oscilar el pH vacuolar da como resultado una desregulación del control bien establecido de la homeostasis del tamaño en la levadura. Si bien el mecanismo exacto de control del tamaño sigue siendo controvertido36,44,49,50,51, nuestros datos sugieren que la regulación dinámica del pH vacuolar y su impacto potencial sobre el pH citoplasmático52 pueden estar desempeñando un papel importante.

En conjunto, este trabajo identifica un nuevo modelo para la regulación dinámica de la capacidad de almacenamiento de metabolitos de un orgánulo en el centro de muchas vías celulares críticas. Dada la importancia y el alto grado de conservación entre humanos y levaduras en todas las vías identificadas en el trabajo descrito aquí, vale la pena señalar que las mutaciones en los complejos conservados Fab1, v-ATPasa y TORC1 tienen impactos en la salud humana53,54,55 , lo que plantea la posibilidad de que defectos en la dinámica del almacenamiento de aminoácidos en la vacuola similar a lisosoma puedan ser la base de aspectos de los mecanismos de iniciación o progresión de una variedad de enfermedades humanas.

Todas las cepas utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla complementaria 1. Todas las cepas prototróficas se derivan del entorno DHY56. Todas las cepas knockout y etiquetadas con genes se crearon en una cepa parental DHY diploide y las cepas haploides se generaron mediante esporulación, disección de tétrada y verificación de la segregación de los marcadores apropiados. Todas las cepas con deleción se elaboraron utilizando los marcadores dominantes de resistencia a los medicamentos descritos por el grupo de Knop57. Las proteínas c-terminales marcadas con mNeon se elaboraron amplificando un casete de integración de pKT127-mNeonGreen. Las cepas que albergaban informadores para monitorear el pH vacuolar se crearon integrando la construcción en el locus HO como se describe usando los plásmidos designados como 'pHO' a continuación. Las cepas que albergan mCherry-Atg18 codificado genómicamente se crearon amplificando un fragmento de PCR que contenía el casete NatMX seguido de la región promotora ADH1 y mCherry. El fragmento completo se integró en el extremo 5' del locus Atg18 nativo y se verificó mediante PCR. Las cepas que expresan Psr1-mRuby2 se crearon amplificando el plásmido pADH1pr-PSR1-mRuby2 con cebadores que permiten la inserción de la construcción en una región vacía del cromosoma I (199,458–199,459) en una cepa ura3- DHY WT. Las cepas que albergan fab1-21a y vac7-7a se crearon amplificando un fragmento de PCR que contenía el casete NatMX siguiendo las variantes mutantes de cada gen. Cada fragmento se integró en el locus nativo Fab1 o Vac7, respectivamente.

pKT127-mNeonGreen se creó amplificando mNeonGreen con sitios PacI y AscI y reemplazando eGFP en pKT127-eGFP59.

pHO-KanMX-TEF1prom-CPYleader-v-SEP-mCherry se creó creando primero un plásmido donante que contenía los primeros 50 aminoácidos de CPY (Prc1) introducidos mediante el recocido de oligonucleótidos complementarios flanqueados por sitios XbaI y SpeI y v-SEP flanqueado por Sitios SpeI y XhoI. Luego se amplificó el fragmento CPYleader-v-SEP mediante PCR para contener sitios BamHI y XhoI flanqueantes y se clonó en p416TEF60 usando esos sitios. Luego se amplificó el TEFprom-CPYleader-v-SEP-CYCterm y se clonó en pHO-KanMX58 usando SmaI. Luego se clonó mCherry (yemCherry) optimizado con codones de levadura en sentido descendente y en el marco de v-SEP utilizando un ensamblaje de ADN de alta fidelidad (NEB) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

pHO-NatMX-TEF1prom-CPYleader-v-SEP-mScarlet se preparó reemplazando el casete KanMX de pHO-KanMX con NatMX usando un fragmento de ADN digerido de pFA6a-NatMX-NT257 flanqueado por AscI y EcoRI. Luego se clonó mScarlet (yemScarlet) optimizado con codones de levadura aguas abajo y en el marco de v-SEP utilizando un ensamblaje de ADN de alta fidelidad (NEB) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

pUC19-ADH1pr-mCherry-Atg18 se preparó amplificando primero el casete NatMX-NT2 de pFA6a-NatNT257 flanqueado por sitios de enzimas de restricción EcoRI y SacI y clonándolo en pUC19. El resto de la construcción se construyó secuencialmente de modo que la construcción final contenía el promotor ADH1 flanqueado por los sitios SacI y XbaI, el fluoróforo yemCherry flanqueado por los sitios XbaI y SalI y el ORF ATG18 flanqueado por SalI y SacI. El ORF yemCherry y ATG18 están separados por un conector de glicina 6x que se introdujo mediante PCR.

pADH1pr-PSR1-mRuby2 se preparó reemplazando la fluorina ratiométrica (RMP) en pADH1pr-PSR1-RMP61 con mRuby2 utilizando los sitios PacI y AscI flanqueantes. Este plásmido está marcado por un casete de selección URA3.

Twist Bioscience sintetizó plásmidos que contenían fab1-21a o vac7-7a con su promotor y terminador nativo flanqueados por sitios NotI y SbfI y los clonó en pUC19. NatMX se amplificó con sitios SbfI flanqueantes y se clonó aguas abajo.

Todos los oligos utilizados para construir cepas de levadura y plásmidos se enumeran en la Tabla complementaria 2.

Todas las construcciones fueron verificadas mediante secuenciación de Sanger.

SDC contenía una mezcla de suplemento SC (Sunrise), una mezcla de YNB + nitrógeno (sulfato de amonio) (Sunrise) y dextrosa al 2 %, pH 4,5. Este medio tenía consistentemente un pH de ~4,5 sin adiciones. YNBD contiene una mezcla de YNB + nitrógeno (sulfato de amonio) (Sunrise) y dextrosa al 2 % y se ajustó a un pH ~4,5 con la adición de KOH para igualar el SDC. Todos los medios de adición de aminoácidos individuales utilizaron 85,6 mg l-1 de aminoácidos, excepto la leucina, que fue 173,4 mg l-1. Todo el medio de adición de aminoácidos individuales se ajustó a un pH ~4,5. SCEG contenía una mezcla de suplemento SC (Sunrise), una mezcla de YNB + nitrógeno (sulfato de amonio) (Sunrise), 2 % de glicerol y 3 % de etanol, pH 4,5. Todos los experimentos y el crecimiento de células de levadura se realizaron a temperatura ambiente.

Se resuspendió rapamicina (Fisher) a 1 mg ml-1 en etanol al 90 %/Tween-20 al 10 % y se usó a una concentración de trabajo de 1 µg µl-1 en SDC. La concanamicina A (MiliporeSigma) se resuspendió a 1 mg ml-1 en dimetilsulfóxido (DMSO) y se usó a una concentración de trabajo de 1 µg ml-1 en SDC. Para todos los tratamientos, las células se cultivaron en dispositivos de microfluidos durante 9 h en medio no tratado y luego el sistema de microfluidos que se describe a continuación inició automáticamente el flujo del medio que contiene el fármaco.

Las células se cultivaron en el medio apropiado durante 24 h y luego se diluyeron a una DO600 apropiada de modo que después de 12 a 16 h de crecimiento la densidad celular estuviera entre DO600 0,05 y 0,1 al día siguiente. Esto sirvió para dos propósitos: lograr la densidad de carga celular adecuada y limitar la acidificación del medio en el cultivo iniciador. Las células se cargaron en una placa CellASIC ONIX para células de levadura haploides (Y04) y el medio apropiado se hizo fluir sobre las células (21 kPa) usando un sistema de microfluidos CellASIC ONIX2 (Millipore) durante 1000 min.

Para los datos presentados en la Fig. 1d, se utilizó una plataforma de microfluidos personalizada para obtener imágenes de la fluorescencia de v-SEP y mCherry cada 5 minutos durante aproximadamente 1000 minutos.

La fluorescencia de v-SEP y mCherry se registró en una Nikon Ti equipada con una cámara Andor Neo sCMOS, conjuntos de filtros FITC/TRITC estándar, una fuente de luz LED Sola 6 (Lumencor) y un objetivo de ×60. Todos los datos se adquirieron como imágenes de plano focal medio único con fluorescencia y datos de campo claro adquiridos cada 2 minutos utilizando una exposición de 50 ms con una intensidad de luz incidente del 12 % para v-SEP y una exposición de 150 ms con una intensidad de luz incidente del 12 % para mCherry.

Las células que expresan v-mScarlet se cultivaron en SDC y los datos de vida útil de la fluorescencia se recopilaron utilizando un microscopio confocal de barrido puntual Leica SP8 equipado con un módulo LSM/FLIM (PicoQuant) para el recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo. Para evitar la fototoxicidad, tomamos imágenes continuamente con una intensidad de láser muy baja. Utilizamos un objetivo HC PL APO CS ×100/1.4 NA, iluminación de un láser de luz blanca sintonizable a 40 MHz con un filtro de excitación 561, un tamaño de píxel de 151,96 nm y un tiempo de permanencia de 97,65 μs. Las imágenes de 256 × 256 píxeles se recopilaron utilizando un orificio abierto en un detector HyD SMD con una ventana de emisión de 581 a 750 nm. Cada imagen requirió 26 s para adquirirse. Utilizamos el software Picoquant para mostrar el tiempo promedio de llegada de los fotones, agrupando cuatro imágenes en el tiempo y aplicando un suavizado bidimensional de 500 nm.

Las células se cultivaron en SDC como se indicó anteriormente y se trataron con BCECF 5 µM (Thermo Fisher). La fluorescencia BCECF se registró en una Leica DMi8 equipada con una cámara pco.edge 4.2 (pco), una fuente de luz LED SpectraX (Lumencor) y un objetivo de ×60. Tanto la fluorescencia BCECF sensible como la insensible al pH se obtuvieron utilizando un filtro de emisión 540/21 y un espejo dicroico FF444/520/590-Di01 (Semrock). La fluorescencia insensible al pH se obtuvo iluminando la muestra con un filtro de paso de banda 427/10 y la fluorescencia sensible al pH utilizó un filtro de paso de banda 540/21. Para ambas señales de fluorescencia, la luz incidente se atenuó al 30% de potencia y se utilizó un tiempo de exposición de 45 ms.

Las células se cultivaron en YNBD + 4cnTrp (85,6 mg l-1) como se describe anteriormente. La fluorescencia de v-SEP y 4cnTrp se registró en una Leica DMi8 equipada con una cámara ORCA-Flash4.0 (Hamamatsu), juegos de filtros FITC/DAPI estándar, un motor de luz Sola (Lumencore) y un objetivo ×100 HC PL Apo TIRF. Todos los datos se adquirieron como imágenes de plano focal medio único con fluorescencia y datos de campo claro adquiridos cada 2 minutos utilizando una exposición de 25 ms con una intensidad de luz incidente del 15 % para v-SEP y una exposición de 200 ms con una intensidad de luz incidente del 15 % para 4cnTrp.

Las células se cultivaron en SDC como se describe anteriormente y se dejaron reposar durante 5 minutos en un no. 1 cubreobjetos de vidrio que se recubrió con 0,1 mg ml-1 de concanavalina A (Fisher). Se utilizó un anillo de grasa de vacío para hacer un pozo abierto alrededor de las células. Después de sedimentar, las células no adheridas se lavaron con medio nuevo y se añadió al pocillo un exceso de medio nuevo (~500 µl). La fluorescencia v-SEP se registró en una Nikon Ti equipada con una cámara Andor Neo sCMOS, juegos de filtros FITC estándar, una fuente de luz LED Sola 6 (Lumencor) y un objetivo de ×60. Todos los datos se adquirieron como imágenes de plano focal medio único con fluorescencia y datos de campo claro adquiridos cada 2 minutos utilizando una exposición de 50 ms con una intensidad de luz incidente del 12% para v-SEP.

Se utilizó un microscopio SOLS con un objetivo primario de silicona Nikon × 100 1,35 para recopilar datos de series temporales volumétricas de un solo color (consulte en otra parte40 los detalles de configuración del microscopio). Para la excitación y emisión de fluorescencia, se utilizó un láser de 561 nm (Coherent OBIS LS 80 mW) junto con un dicroico de cuatro bandas (Chroma ZT405/488/561/640rpcv2) y un filtro de emisión de paso largo (Chroma LP02-561RU). En total, se tomaron 240 volúmenes por conjunto de datos a intervalos de 300 s con un tamaño de vóxel de (116 × 116 × 469) nm3 (108 cortes por volumen y 1060 × 548 píxeles por corte en la práctica). Cada corte de imagen se tomó con una exposición de 100 ms y una potencia láser relativamente baja para minimizar el fotodaño (configuración del 5% + filtro absorbente Thorlabs NDE10A).

Se cultivaron cultivos duplicados en dos días separados (cuatro réplicas en total) en el medio apropiado hasta OD600 = 0,05, se recogieron mediante filtración en filtros de membrana MF (Millipore, HAWP02500) y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las células congeladas se procesaron como se describe en otra parte62. Brevemente, las células se resuspendieron en 200 µl de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8,0, SDS al 0,5 % y EDTA 10 mM) y se separaron de los discos de filtro. Luego, se agregaron 200 µl de fenol ácido, pH 4,3, y las muestras se agitaron durante 30 s. Las muestras se incubaron a 65 °C durante 1 h en un Thermomixer con agitación intermitente (2000 rpm durante 1 min cada 15 min). Luego, se agregaron 400 µl de etanol al 100% y el ARN se purificó usando el kit Direct-zol RNA Miniprep Plus (Zymo Research) de acuerdo con el protocolo del fabricante, incluido el paso de digestión con DNasa. La integridad del ARN se evaluó utilizando un bioanalizador Agilent y una muestra WT se eliminó del análisis porque el ARN era de calidad insuficiente.

El análisis de RNA-seq se ejecutó y visualizó utilizando una plataforma interna basada en web, que consta de los siguientes pasos. El control de calidad de la secuenciación se realizó utilizando FastQC (v.0.11.5). Luego se cuantificó la expresión de la transcripción utilizando Salmon63 (v.0.9.1) en modo de pseudoalineación, sin recorte del adaptador, produciendo estimaciones de transcripción por millón, utilizando el transcriptoma Ensembl (SacCer3). El análisis de expresión diferencial se realizó en R utilizando el paquete Sleuth64 (v.0.29.0), produciendo tamaños de efecto a nivel genético y valores q para atg18∆, vph1∆ y fab1∆ versus WT. Luego se utilizó la lista de genes clasificados por el valor q para realizar GSEA utilizando el paquete fgsea65 (v.1.4.1). Los datos de RNA-seq se depositan en Gene Expression Omnibus (GSE236913).

Las células se cultivaron durante la noche en el medio apropiado, se diluyeron en medio nuevo a OD600 = 0,03–0,05 y se cultivaron durante 2–3 h. Las células se tiñeron en medio con SYTOX Blue 1 µM (Thermo Fisher) durante 5 minutos y luego se analizaron en un analizador de células BD LSRFortessa X-20 equipado con las líneas láser y los juegos de filtros de emisión adecuados. Los datos de FACS se recopilaron con el software FACSDiva (v.9.0). Se analizaron al menos 30.000 células por medio de crecimiento en varios días distintos. En la Fig. 6 de datos ampliados se presenta una estrategia de activación representativa para una muestra (células WT que expresan Arg1-mNeon creciendo en YNBD). Las células vivas se controlaron utilizando la señal SYTOX Blue (puerta 4, Fig. 6 de datos ampliados). Todos los datos de citometría fueron analizados por FlowJo (v.10.8.1). Se realizaron pruebas t bilaterales en R (v.4.1.2) y se asumió la normalidad de los datos debido al gran tamaño de la muestra.

Los datos de los experimentos de microfluidos se procesaron con Fiji (1,53k) y el complemento TrackMate (v.6.0.3). Para procesar los datos para el análisis en TrackMate, los datos de lapso de tiempo se restaron en segundo plano mediante la resta de una bola rodante con un radio de 50 píxeles y luego se registraron utilizando el complemento StackReg66. Luego se utilizó TrackMate para segmentar vacuolas (detector LoG: diámetro estimado de la burbuja de 27 píxeles, umbral de 0,3) y rastrear su fluorescencia en el tiempo (rastreador de vueltas de movimiento lineal: radio de búsqueda inicial de 25 píxeles, radio de búsqueda de 20 píxeles).

Los resultados de TrackMate se analizaron utilizando scripts R personalizados. En resumen, se seleccionaron trazas de intensidad de fluorescencia individuales de modo que hubiera al menos 500 minutos de datos, se eliminó la tendencia de los datos utilizando un modelo lineal de serie temporal (forecast::tslm), se realizó un análisis PSD (Genecycle::periodogram) en el Se anotaron datos sin tendencia y la amplitud máxima y el período de la amplitud máxima para cada traza. Este proceso se repitió sobre todos los datos de cualquier condición de crecimiento particular. Las amplitudes máximas medianas y el IC del 95 % de cada condición de crecimiento o mutante se calcularon utilizando la función datawizard::describe_distribution (data, centrality = 'median', ci = TRUE)) en R (v.4.1.2 (2021-11- 01)).

La levadura BY4741 que expresa v-SEP a partir de un plásmido p416 con un promotor GAP y un terminador CYC1 se cultivó durante la noche en 10 ml de medio SC sin uracilo. Las muestras se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en 500 µl de agua. Luego, se combinaron 10 µl de la resuspensión con 90 µl de tampón Carmody67 a diferente pH en una placa de 384 pocillos y se permeabilizaron usando 1 µl de digitonina al 10% en DMSO. Los espectros de excitación se recogieron en un espectrofotómetro SpectraMax i3x desde debajo de la muestra.

Se añadió 4cnTrp a una serie de pH tamponada67 en placas con fondo de vidrio (Corning) y se midió la fluorescencia (Ex. 360/20, Em. 460/30) con un lector de placas CLARIOstar Plus desde la parte superior de la placa.

Las curvas de calibración de BCECF se obtuvieron permeabilizando levaduras en MES 50 mM, Hepes 50 mM, KCl 50 mM, NaCl 50 mM, acetato de amonio 0,2 M, NaN3 10 mM, 2-desoxiglucosa 10 mM y FCCP 50 µM. El pH del tampón se ajustó en incrementos de 0,5 unidades de pH y las imágenes se adquirieron utilizando los mismos ajustes de adquisición del microscopio utilizados para el lapso de tiempo descrito anteriormente.

Los datos volumétricos 3D se proyectaron en máxima intensidad y se midieron el eje largo y el eje corto de la célula después de separarse de su madre. El volumen celular se calculó utilizando la fórmula para el volumen de un elipsoide V = (4/3) × (eje largo) × (eje corto)2. La duración escalada de G1 se calculó como en otros lugares68. Las pruebas estadísticas de significancia de la pendiente de la regresión lineal y la comparación de los datos de WT y atg18∆ se determinaron utilizando GraphPad Prism 9.

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra y no se excluyeron datos de los análisis. Todas las pruebas estadísticas utilizadas para el análisis están incluidas en los Métodos o en los archivos de Datos Fuente para cada figura. Los datos fueron altamente reproducibles tanto a nivel biológico como técnico.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Más allá de lo que está disponible en el manuscrito, todos los datos (sin procesar y procesados) y las herramientas de análisis o scripts personalizados serán proporcionados por los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a F. Arnold por proporcionar el 4cnTrp. Agradecemos a I. Le Blanc y a todos los miembros del laboratorio Gottschling por su útil discusión y revisión del manuscrito.

Voytek Okreglak

Dirección actual: Altos Labs, Redwood City, CA, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Rachel Ling, Maria Ingaramo.

Calico Life Sciences, LLC, sur de San Francisco, California, EE. UU.

Voytek Okreglak, Rachel Ling, Maria Ingaramo, Nathaniel H. Thayer, Alfred Millett-Sikking y Daniel E. Gottschling

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VO y DEG concibieron y supervisaron el proyecto, diseñaron experimentos, interpretaron los resultados y escribieron el artículo. VO analizó los datos de RNA-seq, NHT y RL realizaron experimentos de microfluidos a gran escala subyacentes a la Fig. 1d. MI creó y caracterizó al reportero de la v-SEP. AM-S. y VO realizaron experimentos utilizando el microscopio de lámina de luz de objetivo único. RL y VO realizaron y analizaron experimentos FACS y realizaron/analizaron todos los demás experimentos en el manuscrito.

Correspondencia a Voytek Okreglak o Daniel E. Gottschling.

Todos los autores son empleados de Calico Life Sciences. El trabajo presentado aquí no tiene valor comercial para Calico, sino más bien una contribución al avance de la comprensión de la biología fundamental.

Nature Metabolism agradece a Patricia Kane y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Alfredo Giménez-Cassina, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(a) Intensidades individuales de mCherry y v-SEP y la relación de las dos señales obtenidas cada 2 minutos durante 1000 minutos. (b) Se obtienen imágenes de las células que expresan v-SEP y Psr1-mRuby2 cada 2 minutos mientras crecen en SDC. Los cambios de intensidad de fluorescencia de v-SEP de una célula se muestran en negro, mientras que la barra vertical discontinua indica el momento en que nació la célula. Las líneas discontinuas verticales verdes y rojas indican el momento del inicio y separación de cada célula hija, respectivamente. (c) células bar1∆ que expresan v-SEP obtenidas imágenes cada 2 minutos mientras crecen en SDC con factor α 200 nM. Las células se someten a una división celular (separación celular indicada por la línea roja discontinua) antes de detenerse (indicada por la línea azul discontinua). (d) Las células que expresan v-SEP se cultivaron en cultivo discontinuo en SDC y se dejaron asentar en un cubreobjetos y se tomaron imágenes cada 2 minutos. Se muestran los cambios de intensidad de v-SEP a lo largo del tiempo para dos celdas. (e) Las células que expresan v-mScarlet se cultivaron en SDC y se capturaron los tiempos de vida de la fluorescencia como se describe en Materiales y métodos. Los tiempos de vida de la fluorescencia fueron pseudocoloreados y superpuestos en imágenes de campo claro con tiempos de vida más largos representados en magenta y tiempos de vida más cortos en verde, correspondientes a un pH más alto y más bajo, respectivamente.

Datos fuente

( a ) Amplitud oscilatoria del pH vacuolar de células de tipo salvaje DHY (n = 301), BY4741 (n = 99) y W303 (n = 90) cultivadas en medios que contienen glucosa y aminoácidos (SDC). La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 * los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores p se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. (b) Se traza el período y la magnitud del pH vacuolar para los experimentos que se muestran en la Fig. 2b (rojo), 2d (negro), 3a (azul), 3d (verde), 3e (magenta), 3 f (cian), Datos ampliados. Fig. 2a (gris) y Datos ampliados Fig. 3b (violeta). La línea negra horizontal sólida es la línea de regresión y el área sombreada en rojo es el intervalo de confianza del 95% alrededor de la línea de regresión.

Datos fuente

(a) Tabla de términos GO regulados hacia arriba y hacia abajo que comparan células de tipo salvaje que crecen en YNBD versus YNBD + Tyr o YNBD + Leu. ( b ) Amplitud del pH vacuolar oscilatorio de gcn2∆ y células de tipo salvaje cultivadas en medios que contienen glucosa y aminoácidos (SDC). La amplitud mediana del pH vacuolar se muestra como diagramas de caja y bigotes con bigotes calculados como 1,5 * los rangos intercuartiles, los valores medianos indicados por la barra roja horizontal y los valores p se calculan mediante una prueba de Dunn bilateral con ajuste de Holm. Los números insertados debajo de los gráficos de barras son el período medio de las oscilaciones del pH vacuolar. (c) Cuadros individuales de imágenes de lapso de tiempo de mCherry-Atg18 y v-SEP durante una ronda de alcalinización vacuolar (igual que la Fig. 4a). Los gráficos inferiores muestran la intensidad de mCherry-Atg18 (trazo rojo) y la intensidad de v-SEP (trazo verde) a lo largo de la línea roja indicada en la imagen de mCherry-Atg18. Se establece una línea discontinua horizontal de referencia en 150 AU para todas las gráficas. (d) Cuadros individuales de imágenes de lapso de tiempo de Vma5-mCherry y v-SEP durante una ronda de alcalinización vacuolar.

Datos fuente

Se añadió 4cnTrp a una serie de pH tamponada67 y se midió la fluorescencia con un lector de placas CLARIOstar Plus. El área sombreada en rojo es el intervalo de confianza del 95% alrededor de la media (línea discontinua).

Datos fuente

( a ) perfiles de expresión de ARNm para mutantes de autofagia extraídos de Kemmeren et. al, 201434 se subdividieron en genes biosintéticos de arginina. Los datos tienen un formato tal que los genes regulados positivamente se muestran en tonos de magenta y los genes regulados negativamente se muestran en tonos de azul. Los cambios de expresión significativos (p-val < 0,05) se resaltan en verde. Todos los valores de significancia son de Kemmeren et. Alabama. ( b ) Histogramas de expresión de Arg3-mNeon analizados mediante citometría de flujo que comparan los niveles de Arg3 en células de tipo salvaje y atg18∆ en medios que contienen aminoácidos. Tipo salvaje x = 287,7 AU frente a atg18∆ x = 369,6 AU, prueba t bilateral p-val < 2,2 × 10−16.

Datos fuente

Se utilizó una estrategia de selección representativa para una muestra (células de tipo salvaje que expresan Arg1-mNeon que crecen en YNBD) para todos los análisis FACS presentados en este manuscrito.

Vídeo complementario 1. Fluorescencia de v-SEP-mCherry en células cultivadas en SDC. Intensidad de v-SEP (izquierda), mCherry (centro) a lo largo del tiempo en células que crecen en SDC en dispositivos CellASICs con imágenes cada 2 minutos. Las señales fusionadas se muestran a la derecha (v-SEP en verde y mCherry en magenta). Vídeo complementario 2. Fluorescencia de v-SEP en células cultivadas en SDC. Fluorescencia de v-SEP (izquierda) a lo largo del tiempo representada (derecha) a partir de vacuolas de dos células representativas que crecen en SDC resaltadas con círculos naranja y azul. Vídeo complementario 3. Fluorescencia de v-SEP en células cultivadas en lotes y obtenidas imágenes después de asentarse sobre un cubreobjetos. Datos de lapso de tiempo de fluorescencia de v-SEP en células adheridas a un cubreobjetos de vidrio directamente de un cultivo SDC cultivado por lotes. Vídeo complementario 4. Vida útil de la fluorescencia de v-mScarlet en células cultivadas en SDC. Imágenes de fluorescencia de por vida de mScarlet dirigida a vacuolares que crecen en SDC. Los tiempos de vida de la fluorescencia están pseudocoloreados y superpuestos en imágenes de campo claro con tiempos de vida más largos representados en magenta y tiempos de vida más cortos en verde, correspondientes a un pH más alto y más bajo, respectivamente. Vídeo complementario 5. Fluorescencia de BCECF en células cultivadas en COSUDE. Los datos de lapso de tiempo muestran el campo claro y la señal radiométrica del BCECF vacuolar acumulado en células que crecen en COSUDE. Vídeo complementario 6. Fluorescencia de v-SEP en células cultivadas en YNBD. Fluorescencia de v-SEP (izquierda) a lo largo del tiempo representada (derecha) a partir de vacuolas de dos células representativas que crecen en YNBD (medio definido con glucosa pero sin aminoácidos) resaltadas con círculos naranja y azul. Vídeo complementario 7. Fluorescencia de v-SEP en células cultivadas en SCEG. Los datos de lapso de tiempo muestran fluorescencia de v-SEP en células que crecen en SCEG (medio definido con las fuentes de carbono respiratorias glicerol/etanol y aminoácidos). Vídeo complementario 8. Fluorescencia de v-SEP en células de tipo salvaje tratadas con rapamicina. Los datos de lapso de tiempo muestran la fluorescencia de v-SEP en células que crecen en el tratamiento previo y posterior a la rapamicina con SDC.

Vídeo complementario 9. Fluorescencia de v-SEP en células de tipo salvaje tratadas con ConcA. Los datos de lapso de tiempo muestran la fluorescencia de v-SEP en células que crecen en el tratamiento con SDC antes y después del tratamiento ConcA. Vídeo complementario 10. Fluorescencia de mCherry-Atg18 y v-SEP en células de tipo salvaje cultivadas en SDC. Los datos de lapso de tiempo muestran la fluorescencia de mCherry-Atg18 (izquierda) y v-SEP (derecha) en células que crecen en SDC. Vídeo complementario 11. Fluorescencia de 4cnTrp y v-SEP en células de tipo salvaje cultivadas en YNBD+4cnTrp. Los datos de lapso de tiempo muestran fluorescencia de 4cnTrp (izquierda) y fluorescencia de v-SEP (derecha) en células que crecen en SDC antes del tratamiento con ConcA y después del tratamiento con ConcA. Vídeo complementario 12. Fluorescencia de Psr1-mRuby2 en células de tipo salvaje obtenidas mediante microscopía de lámina luminosa de objetivo único. Proyecciones de intensidad máxima de datos de lapso de tiempo volumétrico completo de la fluorescencia de Psr1-mRuby2 en células de tipo salvaje cultivadas en SDC. Vídeo complementario 13. Fluorescencia de Psr1-mRuby2 en células atg18∆ obtenidas mediante microscopía de lámina luminosa de objetivo único. Proyecciones de intensidad máxima de datos de lapso de tiempo volumétrico completo de fluorescencia Psr1-mRuby2 en células atg18∆ cultivadas en SDC.

Cepas utilizadas en este estudio.

Oligonucleótidos utilizados en este estudio.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 1.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 2.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 3.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 4.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 5.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 6.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 7.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la figura 1 ampliada.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la figura 2 ampliada.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 3 extendida.

Elementos de datos fuente y adicionales que respaldan la figura 4 ampliada.

Fuente y elementos de datos adicionales que respaldan la Fig. 5 extendida.

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Okreglak, V., Ling, R., Ingaramo, M. et al. La dinámica del pH vacuolar ligada al ciclo celular regula la homeostasis de los aminoácidos y el crecimiento celular. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00872-1

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Recibido: 03 de junio de 2022

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 28 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00872-1

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