Perfil metabolómico plasmático en dos líneas de conejos seleccionadas de manera divergente por su contenido de grasa intramuscular

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 893 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Este estudio proporciona una comparación exhaustiva del metaboloma plasmático de dos líneas de conejos seleccionadas de manera divergente por su contenido de grasa intramuscular (IMF). La selección divergente condujo a una respuesta correlacionada en la adiposidad general, convirtiendo estas líneas en un material animal valioso para estudiar también la genética de la obesidad. Se detectaron más de 900 metabolitos, y el ajuste de modelos multivariados, tanto discriminantes como lineales, permitió identificar 322 con abundancias diferenciales entre líneas, que también se ajustaron linealmente al contenido de FMI. Las vías más afectadas fueron las de lípidos y aminoácidos, con diferencias entre líneas que oscilaron entre 0,23 y 6,04 desviaciones estándar, lo que revela una capacidad limitada de la línea de bajo FMI para obtener energía a partir de lípidos, y un mayor catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada en la línea alta del FMI se relacionaba con su mayor contenido en el FMI. Además, los cambios en los metabolitos derivados de la actividad microbiana respaldaron su papel relevante en la deposición de lípidos. Las investigaciones futuras se centrarán en el análisis del perfil metabolómico del contenido del ciego y en la integración de los diversos conjuntos de datos -ómicos disponibles para estas líneas, para ayudar a desentrañar los mecanismos biológicos del huésped y del microbioma involucrados en la deposición del FMI.

El contenido de grasa intramuscular (FMI) es un parámetro clave de la calidad de la carne1, que influye en múltiples características como ternura, jugosidad, capacidad de retención de agua, etc.2. En la Universitat Politècnica de València se realizó en conejos un experimento de selección divergente para IMF en el músculo Longissimus Thoracis et Lumborum (LTL)3,4. Como resultado, se crearon dos líneas de conejos, una con alto contenido de FMI (H) y la otra con bajo contenido de FMI (L). La selección partió de la misma población base, y ambas líneas fueron criadas simultáneamente en las mismas condiciones ambientales y alimentadas con la misma dieta, por lo que las diferencias encontradas entre ellas pueden atribuirse directamente a su composición genética. Esta selección condujo a una respuesta correlacionada en la adiposidad general, lo que convierte a estas líneas en un material animal valioso para estudiar también la genética de la obesidad.

En los últimos años se han utilizado diversas técnicas -ómicas para obtener una mejor caracterización de la calidad de la carne5, centrándose en varias de las características antes mencionadas, entre ellas la IMF6,7,8,9,10. Entre esas técnicas, la metabolómica ha ganado especial atención y se considera un factor clave en los enfoques de fenotipado de próxima generación11,12. Los metabolitos son el conjunto de moléculas orgánicas de pequeña masa molecular que se encuentran en una muestra biológica. Son la última respuesta de los sistemas biológicos a los efectos genéticos y ambientales antes de la expresión del fenotipo, por lo que se consideran un fenotipo intermedio13. El análisis del perfil metabolómico ha brindado información valiosa sobre los mecanismos biológicos que controlan diferentes rasgos de calidad de la carne y la canal14,15,16,17. Por ejemplo, el contenido urinario de ácidos biliares y esteroides se asoció con el marmoleo en el ganado, aunque esa asociación varió dependiendo de la ganancia diaria promedio del animal, el tiempo de muestreo y la dieta17. Li et al.18, por otro lado, encontraron varios metabolitos plasmáticos relacionados con rasgos de mérito de la canal en ganado vacuno, y cada uno de ellos representa solo del 0,8 al 2,71 % de la varianza fenotípica, lo que refleja la naturaleza compleja de los rasgos. En cerdos, una mayor concentración plasmática de aminoácidos de cadena ramificada19 y una concentración sérica de L-carnitina15 se asociaron con un mayor contenido de FMI, e incluso se propusieron como biomarcadores. Los primeros estudios evidenciaron la variedad de vías metabólicas que afectan el contenido de FMI y otros rasgos de calidad de la carne y la canal. Un análisis metabolómico de estas líneas divergentes nos permitirá observar más de cerca los mecanismos genéticamente determinados responsables de la deposición de grasa, brindando información relevante que podría extrapolarse al estudio de la obesidad.

Sobre estas líneas ya se han realizado estudios genómicos y metagenómicos que evidencian, por un lado, varios genes relacionados con el contenido de IMF y su composición en ácidos grasos20,21 y, por otro, la importancia de la actividad del microbioma en el depósito de lípidos en el músculo. y otros tejidos adiposos22. En este estudio, se utilizó un enfoque metabolómico no dirigido para identificar los cambios inducidos genéticamente en el perfil metabólico plasmático de las líneas divergentes del FMI, revelando las rutas metabólicas involucradas en su diferenciación. Los resultados obtenidos revelaron una amplia y variada respuesta a la selección, afectando principalmente a los metabolismos de lípidos y aminoácidos, y en menor medida al de carbohidratos y vitaminas A y E. Se observó un aumento general de lípidos en el plasma de la línea L. , lo que sugirió una alteración de la β-oxidación de los ácidos grasos. Estos resultados indican una capacidad limitada de la línea L para obtener energía de los lípidos, reduciendo en consecuencia su absorción y reesterificación en el tejido muscular y adiposo. Los resultados más relevantes dentro del metabolismo de los aminoácidos estuvieron relacionados con los BCAA, lo que sugirió una menor degradación en el intestino de la línea H, seguida de un mayor catabolismo por parte del huésped. Además, estos resultados respaldaron la importancia de la actividad del microbioma, relacionando varios metabolitos derivados del metabolismo del microbioma intestinal con la deposición de lípidos y, lo que es más importante, validando algunos de los resultados encontrados en el estudio metagenómico realizado previamente22.

El efecto de los metabolitos en el desarrollo del rasgo se infirió a partir de funciones extraídas de la literatura y de resultados previos encontrados en estas líneas divergentes. No se realizó validación funcional, lo que puede representar una limitación del presente estudio. Las investigaciones futuras se centrarán en el análisis del perfil metabolómico del contenido del ciego y en la integración de varios conjuntos de datos -ómicos disponibles para estas líneas, lo que ayudará a desentrañar los mecanismos biológicos del huésped y del microbioma y su interacción involucrada en la deposición del FMI. .

La metabolómica ha demostrado ser una herramienta poderosa, y los análisis realizados en esta línea arrojaron muchos metabolitos relacionados con el depósito de grasa intramuscular, lo que permitió hacer importantes inferencias sobre los mecanismos biológicos que conducían a un mayor o menor depósito de grasa. En este estudio, después del procesamiento de datos, se conservaron 920 metabolitos para análisis posteriores (242 positivos tempranos, 168 positivos tardíos, 399 negativos y 111 polares), de los cuales 789 eran entidades conocidas. Los metabolitos de referencia elegidos para la transformación alr de cada conjunto de datos, siguiendo la metodología descrita por Greenacre et al.23, fueron: prolina para el conjunto de datos tempranos positivos, esfingomielina (d18:2/24:1, d18:1/24:2 ) para el conjunto de datos positivos tardíos, N-acetil valina para el conjunto de datos negativos y glucosa para el conjunto de datos polares.

Los parámetros de ajuste de los modelos PLS-DA ajustados con datos verdaderos y permutados se muestran en la Tabla 1 (datos complementarios 1 y 2), mientras que los de los modelos PLS se muestran en la Fig. 1a (datos verdaderos; datos complementarios 3) y la Fig. .1b (datos permutados; datos suplementarios 4). Como se puede observar en la tabla de errores de clasificación promedio, los modelos PLS-DA mostraron una buena capacidad de clasificación de alrededor del 95%, mientras que la de la prueba de permutación fue alrededor del 50%, evidenciando la robustez de los modelos PLS-DA ajustados con el original. datos (Tabla 1). De manera similar, el parámetro Q2 estimado para los modelos PLS mostró una buena precisión de predicción (media: 65%; Fig. 1a), y esto fue respaldado por la precisión de predicción obtenida de la prueba de permutación (Fig. 1b). Estos resultados mostraron que había una importante respuesta correlacionada a la selección en el metaboloma plasmático de las líneas.

Distribución de todos los valores de Q2 obtenidos de los modelos PLS ajustados durante el procedimiento de validación cruzada con (a) datos verdaderos y con (b) datos permutados.

Una vez desarrollados los modelos PLS-DA y PLS y validado su rendimiento, se seleccionaron los metabolitos relevantes según el procedimiento descrito anteriormente. Sin embargo, 16 de los 160 modelos PLS que presentaron una mala precisión de predicción (Q2 <0,4) no se consideraron para la selección (Fig. 1a). Los datos complementarios 5 muestran el perfil metabolómico completo obtenido, junto con un resumen de los resultados obtenidos de los modelos PLS-DA y PLS. En un experimento de selección divergente, las líneas se crean a partir de la misma población base, se alimentan con la misma dieta y se crían simultáneamente en las mismas condiciones ambientales, lo que significa que se espera que las diferencias encontradas entre ellas se deban principalmente a su composición genética. . Sin embargo, esas diferencias también pueden deberse a la deriva genética que se produjo durante el procedimiento de selección. Por otro lado, aunque el análisis PLS asocia metabolitos al rasgo IMF (independientemente de la línea), los valores extremos de este rasgo probablemente se deben a causas ambientales. Por lo tanto, considerar los metabolitos que se seleccionaron tanto en los enfoques PLS-DA como en PLS corrobora que esas diferencias probablemente se deban a causas genéticas. Finalmente, se consideraron como respuesta correlacionada a la selección 322 metabolitos que presentaron diferencias entre líneas (seleccionados con el PLS-DA) y ajustados linealmente al rasgo IMF (seleccionados con el PLS) (Fig. 2a).

un diagrama de Venn de los metabolitos seleccionados utilizando enfoques PLS-DA y PLS; b clasificación de los 322 metabolitos seleccionados.

Los 322 metabolitos seleccionados se muestran en los datos complementarios 6, junto con las rutas metabólicas en las que participan. Considerando la cantidad de metabolitos encontrados, los metabolismos más afectados fueron el de lípidos (159) y aminoácidos (65). Los metabolitos restantes participaron en el metabolismo de xenobióticos (21), cofactores y vitaminas (14), nucleótidos (10), péptidos (9), carbohidratos (6) y energía (3) (Fig. 2b y datos complementarios 6). . Finalmente, hubo 33 metabolitos que no pudieron identificarse y 2 que eran moléculas parcialmente caracterizadas. Esta gran y variada respuesta a la selección encontrada en el metaboloma plasmático concuerda con el gran componente poligénico encontrado en un estudio de asociación de todo el genoma (GWAS) realizado previamente en estas líneas20.

Los metabolitos lipídicos encontrados se pueden clasificar como se muestra en la Fig. 3 (datos complementarios 6). La mayoría de estos metabolitos fueron más abundantes en el plasma de la línea L (127 de 159; ver datos complementarios 6) y los más relevantes fueron los ácidos grasos no esterificados (NEFA), incluidos los de cadena media, cadena ramificada y larga. ácidos grasos saturados de cadena (LC), LC monoinsaturados y LC poliinsaturados (0,51 a 1,27 DE, P0 ≥ 0,96), monoacilgliceroles (MAG; 0,73 a 0,94 DE, P0 ≥ 0,99), diacilgliceroles (DAG; 0,84 a 6,04 DE, P0 = 1), acilcarnitinas (0,29 a 1,56 DE, P0 ≥ 0,84), acilglicinas (0,41 a 1,50 DE, P0 ≥ 0,92) y ácidos dicarboxílicos (0,27 a 1,44 DE, P0 ≥ 0,83). Otros cambios en el metabolismo lipídico se reflejaron en la mayor abundancia en la línea L de colesterol (1,11 DE, P0 = 1), sulfato de colesterol (0,89 DE, P0 = 1), ácidos biliares secundarios (0,61 a 1,01 DE, P0 ≥ 0,98 ), esfingomielinas (0,73 a 1,62 DE, P0 ≥ 0,91) y plasmalógenos (0,44 a 1,28 DE, P0 ≥ 0,94), y la menor abundancia de lisofosfolípidos (0,74 a 1,53 DE, P0 ≥ 0,99). Las diferencias en colesterol y ácidos biliares también se observaron en el plasma de la línea L en la décima generación de selección24. Además, experimentos previos también encontraron mayor cantidad de triglicéridos en el plasma de la línea L24,25.

Número de metabolitos diferencialmente abundantes encontrados para cada subvía lipídica.

Los ácidos biliares son derivados polares del colesterol y desempeñan un papel esencial en la digestión y absorción de lípidos en el intestino26. La mayor cantidad de colesterol y triglicéridos observada anteriormente puede estar relacionada con la mayor cantidad de ácidos biliares, aunque se necesitan más análisis para confirmar esta teoría. A pesar de esta mayor cantidad de colesterol y triglicéridos, las diferencias encontradas en todos los metabolitos lipídicos mencionados anteriormente, pueden sugerir una capacidad limitada de la línea L para obtener energía de esos lípidos, provocando su acumulación junto con la de sus productos catabólicos, como se verá. discutido después. Los NEFA y MAG encontrados en este experimento son productos de la actividad de la lipoproteína lipasa (LPL) sobre los triglicéridos27. También se encontraron mayores NEFA circulantes en cerdos con menor contenido de IMF causado por los genotipos CC y CT del gen LEPR; sin embargo, la diferencia se atribuyó a una mayor movilización de grasa en esos cerdos28. Otros productos de la hidrólisis de los triglicéridos, como el glicerol y el glicerol-3-fosfato, también fueron relevantes en la discriminación, con un 96% (glicerol) y un 98% (glicerol-3-fosfato) de probabilidad de ser más abundantes en la línea L. (datos complementarios 6). Aunque esos metabolitos no superaron el umbral del 80% en ambos modelos (datos complementarios 5), la evidencia estadística, junto con su estrecha relación con los NEFA y MAG, sugieren que también deberían considerarse en la discusión.

Los ácidos grasos obtenidos de la hidrólisis de los triglicéridos serían luego absorbidos por las células, donde serían oxidados para obtener energía, mediante β-oxidación, o reesterificados para su almacenamiento29. La β-oxidación de los ácidos grasos tiene lugar en el interior de las mitocondrias, donde los ácidos grasos de cadena larga no pueden ser transportados pasivamente a través de la membrana plasmática y deben unirse a la carnitina, formando acilcarnitinas, para ser transportadas a través de la lanzadera de carnitina29. En este experimento, 14 de las 16 acilcarnitinas encontradas fueron más abundantes en la línea L. Las únicas excepciones fueron las acilcarnitinas cortas butirilcarnitina (0,82 DE, P0 = 1) y propionilcarnitina (0,74 DE, P0 = 0,99), que también están relacionadas con el metabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) y se analizarán más adelante. Además, la carnitina fue más abundante en el plasma de la línea H (0,74 DE, P0 = 0,99), lo que ya ha sido propuesto como biomarcador de mayor calidad de la carne y contenido de IMF en cerdos15. Las acilcarnitinas pueden aumentar en el plasma para evitar la acumulación de acil-COA tóxicos en las mitocondrias causadas por trastornos en la β-oxidación. Este mecanismo de desintoxicación, que se ha observado en individuos con diabetes tipo 2 y resistencia a la insulina, consiste en el regreso de las acilcarnitinas al torrente sanguíneo, lo que provoca un aumento del nivel de acilcarnitinas plasmáticas y una disminución del nivel de carnitina libre30, como se observa en estos líneas. Las acilglicinas, que son metabolitos menores de los ácidos grasos, también se forman para prevenir la acumulación de acil-CoA tóxica y, en humanos, este mecanismo de desintoxicación se ha observado en individuos con trastornos de la oxidación de ácidos grasos de cadena corta y media31. Otros resultados que apoyan esta teoría son la mayor abundancia de ácidos dicarboxílicos y DAG. Los ácidos dicarboxílicos se forman a partir de la ω-oxidación de ácidos monocarboxílicos cuando se altera la β-oxidación de NEFA32, mientras que se ha observado una mayor síntesis de DAG cuando se altera la absorción y oxidación de ácidos grasos33. La menor β-oxidación en la línea L también puede estar respaldada por la menor actividad de la β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, una enzima de la vía de la β-oxidación, encontrada en el músculo LTL de la línea L en un experimento previo34.

La acumulación de triglicéridos y sus subproductos catabólicos, junto con la acumulación de acilcarnitinas, acilglicinas y ácidos dicarboxílicos, y la carnitina más baja en la línea L plasmática sugieren una absorción reducida en los músculos y otros tejidos adiposos, seguida de una menor y posiblemente alterada la β-oxidación de los ácidos grasos, lo que podría explicar en parte su menor contenido en grasa.

Los metabolitos del metabolismo de los aminoácidos encontrados estuvieron involucrados en varias vías, como se puede ver en la Fig. 4 (datos complementarios 6). Entre esas vías destaca el metabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) (leucina, isoleucina y valina). Los BCAA son aminoácidos esenciales que desempeñan numerosas funciones metabólicas y reguladoras, y se han asociado con un aumento de la lipólisis, pero también con un aumento de la lipogénesis35. Su concentración en sangre se ha asociado positivamente con el contenido de FMI en cerdos19 y bovinos16, y con la obesidad y la resistencia a la insulina en humanos36. En este experimento no se encontraron diferencias en valina, leucina e isoleucina, pero se encontraron mayores abundancias de los aminoácidos modificados (N-acetil leucina, N-lactoil leucina, N-lactoil isoleucina y N-lactoil valina) en el plasma. de la línea H (0,54–0,75 DE, P0 ≥ 0,96), junto con varios metabolitos de su catabolismo, incluidas las especies asociadas a BCAA butirilcarnitina y propionilcarnitina mencionadas anteriormente (0,35–1,97 DE, P0 ≥ 0,88). Excepcionalmente, la isovalerilglicina y la 3-metilcrotonilglicina fueron más abundantes en el plasma de la línea L; sin embargo, estos metabolitos son acilglicinas, que también se forman como metabolitos menores de los ácidos grasos, como se mencionó anteriormente. En el GWAS realizado en estas líneas, el gen BCAT1, que codifica la primera enzima de la vía catabólica de BCAA expresada en el citosol, se localizó en una de las regiones asociadas al contenido de IMF20. Este gen también se ha asociado con la obesidad en humanos en un estudio de asociación de todo el epigenoma37, donde se encontró en un estado hipometilado. Además, un estudio en ratones demostró que la alteración del gen BCAT2, expresado en las mitocondrias, conducía a un menor catabolismo de los BCAA, lo que consecuentemente conducía a un menor contenido de grasa38. Los resultados encontrados en este experimento sugieren un mayor catabolismo de BCAA en la línea H que podría explicar en parte su mayor contenido en IMF, como se observa en humanos39, aunque los mecanismos no se entienden del todo36.

Número de metabolitos diferencialmente abundantes encontrados para cada subvía de aminoácido.

Otros cambios en las concentraciones plasmáticas de aminoácidos incluyeron mayores abundancias en la línea L de glicina (1,55 DE, P0 = 1) y serina (1,04 DE, P0 = 1), junto con metabolitos del metabolismo de la creatina (0,75–1,18 DE, P0 = 1), el metabolismo de la lisina (0,75–1,14 DE, P0 = 1), el metabolismo del glutamato (0,37–1,37 DE, P0 ≥ 0,9), el metabolismo de la poliamina (0,23–1,77 DE, P0 ≥ 0,8) y el ciclo de la urea. Metabolismo de arginina y prolina (0,66–1,38 DE, P0 ≥ 0,98). Por otro lado, la línea H tuvo mayores abundancias plasmáticas de alanina (1,03 DE, P0 = 1), aspartato (0,81 DE, P0 = 1), asparagina (0,52 DE, P0 = 0,96), junto con metabolitos de la metionina, metabolismo de cisteína, S-adenosil metionina (SAM) y taurina (0,54–0,75 DE, P0 ≥ 0,96). Entre ellos, destaca el metabolismo de la arginina por la estrecha relación entre la arginina y la adiposidad. La suplementación con arginina se ha asociado negativamente con la adiposidad en humanos obesos con diabetes tipo 240, ratas41, 42, cerdos43 y pollos de engorde44, y también se ha demostrado que retarda la progresión de la aterosclerosis en conejos alimentados con una dieta alta en colesterol45. Se han propuesto mecanismos potenciales46, que incluían la síntesis mejorada de moléculas de señalización celular como las poliaminas, que también eran más abundantes en el plasma de la línea L. Además, el estudio en cerdos mencionado anteriormente demostró que la suplementación con arginina tuvo un efecto sobre el metabolismo microbiano intestinal43. Aunque estas líneas son alimentadas con la misma dieta, el análisis metagenómico realizado en estas líneas encontró una mayor abundancia del gen arcA22, que codifica un regulador positivo de la vía catabólica de la arginina47. Estos resultados podrían indicar que, a pesar de la misma ingesta de arginina, la composición del microbioma de la línea L podría conducir a una mayor utilización.

Se ha demostrado que la microbiota intestinal tiene un gran efecto sobre el metaboloma sanguíneo48,49, que a su vez es independiente del efecto genético del huésped50. En este experimento, varios metabolitos encontrados estaban relacionados con el metabolismo del microbioma intestinal y sus diferencias indican cambios en la actividad microbiana de las líneas. Como se mencionó anteriormente, los ácidos biliares secundarios, que incluían litocolato, glicolitocolato y glucurónido de ácido desoxicólico, eran más abundantes en el plasma de la línea L. Los ácidos biliares son derivados polares del colesterol y desempeñan un papel esencial en la digestión y absorción de lípidos en el intestino26. Los ácidos biliares secundarios son sintetizados a partir de los ácidos biliares primarios por las bacterias intestinales, lo que destaca la importancia de las interacciones entre la microbiota y los ácidos biliares en la homeostasis energética. Un análisis metagenómico del contenido de ciego realizado en la décima generación de selección confirmó la importancia de la funcionalidad de la microbiota intestinal en la deposición del FMI; sin embargo, no se encontró una asociación clara entre los genes microbianos implicados en la formación de ácidos biliares secundarios y el contenido de FMI22. Se necesitan más estudios para dilucidar el papel de los ácidos biliares secundarios en la homeostasis energética de estas líneas.

También se ha demostrado que los niveles de BCAA en plasma discutidos anteriormente dependen de la composición del microbioma51. En línea con los hallazgos de Ridaura et al.51, el análisis metagenómico realizado en la décima generación mostró una mayor abundancia de genes implicados en la degradación de los BCAA en la línea L, contribuyendo a la disminución de los BCAA circulantes observada en esta línea y al menor FMI. contenido en la línea mencionada22. Además, el metabolismo de los aminoácidos aromáticos (AAA), triptófano, tirosina y fenilalanina también está relacionado con el metabolismo del microbioma y también se vio afectado por la selección. Se observaron mayores abundancias del aminoácido modificado N-lactoilfenilalanina (0,49 DE, P0 = 0,95) y de metabolitos del metabolismo del triptófano (0,25–0,78 DE, P0 ≥ 0,81) y tirosina (0,56–0,71 DE, P0 ≥ 0,97). Se encuentra en la línea H. Junto con los BCAA, los AAA pueden ser metabolizados por el huésped o por la microbiota intestinal52, y se ha demostrado que aumentan en la obesidad53. En este experimento, la mayoría de los metabolitos del metabolismo AAA encontrados se derivaron directa o indirectamente del intestino, excepto la quinurenina, que es un producto del catabolismo del triptófano a través de la vía de la quinurenina del huésped. Esta vía también se utiliza para la biosíntesis del cofactor NAD, y su precursor, la nicotinamida, también fue más abundante en el plasma de la línea H (0,57 DE, P0 = 0,98). Finalmente, los metabolitos del metabolismo de la histidina también fueron más abundantes en el plasma de la línea H (0,30–0,74 DE, P0 ≥ 0,85). Entre esos metabolitos se encontró el propionato de imidazol, que es producido por la microbiota intestinal. El propionato de imidazol puede modular la inflamación y el metabolismo del huésped, se ha relacionado positivamente con la obesidad y la diabetes54,55, e incluso se ha propuesto como predictor de diversidad α49.

Estos resultados resaltan la importancia de la actividad del microbioma en el metabolismo del huésped y su relación directa con la determinación del rasgo. Un análisis metabolómico del contenido intestinal de estas líneas permitiría conocer mejor la actividad del microbioma y confirmar los resultados obtenidos hasta ahora.

Se detectaron otros cambios interesantes en el metabolismo de las vitaminas A y E. Se encontraron mayores abundancias de retinol (vitamina A; 0,76 DE, P0 = 0,99), α-tocoferol (vitamina E; 0,82 DE, P0 = 1) y β/γ-tocoferol (vitamina E; 0,84 DE, P0 = 1) en el plasma de la línea H, junto con metabolitos del catabolismo de la vitamina E (α-CEHC y α-CEHC glucurónido; 0,52 a 0,67 DE, P0 ≥ 0,96). La suplementación dietética con vitamina A tiene efectos contradictorios sobre el desarrollo del tejido adiposo intramuscular, promoviendo la hiperplasia preadipocitaria e inhibiendo la maduración final de los adipocitos56. Dado que estas líneas son alimentadas con la misma dieta, la diferencia encontrada entre ellas debe deberse a su metabolismo, tal como se observó en bovinos con diferente eficiencia alimenticia57. Por otro lado, los metabolitos de la vitamina E tienen una importante actividad antioxidante, pudiendo actuar también como moléculas de señalización y regulación genética en vías relacionadas con el metabolismo lipídico58. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre las vitaminas A y E, y dado que influyen en muchas reacciones metabólicas, no está claro cómo su metabolismo afecta la deposición de grasa intramuscular de estas líneas. Sin embargo, estos resultados indican una asociación interesante que podría investigarse más a fondo.

El metabolismo glicolítico y energético también se vio afectado por la selección. No se encontraron diferencias entre líneas en la concentración de glucosa plasmática ni en el experimento anterior24,25 ni en este. Sin embargo, se encontraron mayores abundancias de metabolitos involucrados en el metabolismo de los aminoácidos (0,68 a 1,30 DE, P0 ≥ 0,99), el metabolismo de la fructosa, manosa y galactosa (0,54–1,77 DE, P0 ≥ 0,97) y el metabolismo de las pentosas (0,53 DE, P0 = 0,96) se encontraron en el plasma de la línea L. Estos resultados concuerdan con otro estudio realizado, en el que se encontró mayor abundancia de lactosa en la leche de la línea L, sugiriendo un mayor metabolismo de los carbohidratos en la línea mencionada (resultados aún no publicados). No está del todo clara la relación con el depósito de grasa intramuscular; no obstante, estos resultados podrían sugerir diferencias en la utilización de glucosa entre líneas.

El diseño experimental y el análisis realizado en este estudio permitieron obtener el perfil metabolómico determinado genéticamente de las líneas divergentes, el cual está directamente relacionado con su contenido de grasa intramuscular. Los resultados obtenidos mostraron que hubo una respuesta amplia y variada a la selección en el metaboloma plasmático, lo que coincide con el gran componente poligénico encontrado en el GWAS realizado previamente.

Las vías más afectadas encontradas fueron las de lípidos y aminoácidos. Hubo un aumento general de lípidos en el plasma de la línea L, lo que sugirió una alteración de la β-oxidación en la línea mencionada. Estos resultados indicaron una capacidad limitada de la línea L para obtener energía de los lípidos, reduciendo en consecuencia su absorción y reesterificación en el tejido muscular y adiposo. Los resultados más relevantes dentro del metabolismo de los aminoácidos estuvieron relacionados con los BCAA, lo que sugirió una menor degradación en el intestino de la línea H, seguida de un mayor catabolismo por parte del huésped. Finalmente, los cambios encontrados en los ácidos biliares secundarios, tanto en los aminoácidos de cadena ramificada como en los aromáticos, y también en los metabolitos del metabolismo de la arginina y la histidina, respaldaron el papel relevante de la actividad del microbioma en el desarrollo del rasgo, reforzando los resultados del análisis metagenómico realizado previamente.

El Comité de Ética de la Investigación aprobó todos los procedimientos experimentales de acuerdo con las Directivas del Consejo 98/58/CE y 2010/63/UE (número de referencia 2017/VSC/PEA/00212). Los conejos utilizados para este experimento provienen de dos líneas seleccionadas de manera divergente por el contenido de grasa intramuscular (IMF) en el músculo Longissimus thoracis et lumborum (LTL). El procedimiento de selección completo se describe en Martínez-Álvaro et al.4. Brevemente, la selección divergente comenzó a partir de una población base de 13 toros y 83 hembras, originando una línea con alto contenido de FMI (H) y otra con bajo contenido de FMI (L). Las líneas se criaron simultáneamente en las mismas condiciones ambientales y se les alimentó con la misma dieta. Las camadas fueron destetadas a los 28 días, luego alojadas colectivamente y alimentadas ad libitum hasta el sacrificio con una dieta comercial estándar que contenía 16% de proteína cruda, 16,5% de fibra cruda y 2,4% de grasa, 7,6% de cenizas, 0,8% de calcio, 0,6% de fósforo, 0,26% de sodio; y suplementado con vitamina A (10.000 UI/kg), vitamina D3 (900 UI/kg), vitamina E (25 mg/kg), hierro (78 mg/kg), carbonato de cobalto (0,30 mg/kg), manganeso (20 mg/kg), zinc (50 mg/kg), selenio (0,05 mg/kg), yoduro de potasio (1,0 mg/kg), cobre (8 mg/kg) y antibiótico bacitracina zinc (100 ppm). La composición de ácidos grasos de la dieta, expresada como porcentaje del total de ácidos grasos fue: 54,8% de C18:2n6, 19,7% de C18:1n9, 16,6% de C16:0, 5,7% de C18:3n3, 1,8% de C18 :0, 0,5% de C16:1 y 0,9% de ácidos grasos con más de 20 átomos de carbono.

Para realizar la selección, se sacrificaron dos hermanos completos (un macho y una hembra) del primer parto de cada coneja a las 9 semanas de edad y se extirpó, picó y liofilizó el músculo LTL. Luego se cuantificó el contenido de IMF mediante espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS) aplicando las ecuaciones desarrolladas por Zomeño et al. (2011)59, y expresado como g IMF/100 g de músculo fresco. Las hembras se clasificaron según el valor IMF promedio obtenido de su descendencia, y el 20% superior de las hembras proporcionó todas las hembras para la siguiente generación. Cada toro se cruzó con seis hembras, se clasificaron las parejas y solo se seleccionó una progenie masculina de la pareja mejor calificada de cada toro para la siguiente generación para reducir la endogamia.

La carne de conejo se caracteriza por su bajo contenido en grasas. El músculo LTL tiene el menor contenido graso60, y en estas líneas tuvo una media de 1,06 g IMF/100 g de músculo fresco. La selección divergente realizada fue exitosa, logrando una diferencia en la 9ª generación de 0,45 g IMF/100 g de músculo fresco, equivalente a 3,1 desviaciones estándar del rasgo20.

El metaboloma plasmático se cuantificó en 24 conejos de la línea H (12 machos y 12 hembras) y 24 de la línea L (12 machos y 12 hembras) de la novena generación de selección (ver Datos complementarios 7). Los animales fueron sacrificados a las 9 semanas de edad tras 4 h de ayuno y se recogieron muestras de sangre de la vena yugular en tubos que contenían EDTA K2 como anticoagulante (Deltalab, Rubí, España). Las muestras se centrifugaron inmediatamente a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para separar el plasma, que finalmente se almacenó a -80 °C. Las muestras de plasma se enviaron al laboratorio Metabolon, Inc. (Morrisville, Carolina del Norte, EE. UU.) para su análisis mediante UPLC-MS/MS: cromatografía líquida de ultra rendimiento (ACQUITY UPLC System, Waters) acoplada a espectrometría de masas en tándem (Q-Exactive Orbitrap de alta resolución/masa precisa, Thermo Scientific) interconectado con una fuente de ionización por electropulverización calentada (HESI-II). El analizador de masas Orbitrap funcionó con una resolución de 35.000 masas.

Las muestras se prepararon utilizando el sistema automatizado MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, Nevada, EE. UU.). Las proteínas se precipitaron con metanol con agitación vigorosa durante 2 minutos (Glen Mills GenoGrinder 2000) seguido de centrifugación. Luego, las muestras se colocaron brevemente en un TurboVap® (Zymark) para eliminar el disolvente orgánico y finalmente se almacenaron durante la noche bajo nitrógeno. Luego, se tomaron cuatro alícuotas de cada extracto de muestra y se reconstituyeron en disolventes compatibles con diferentes metodologías: dos fases inversas (RP)/UPLC-MS/MS separadas con ionización por electropulverización (ESI) en modo de iones positivos, una RP/UPLC-MS/MS con ESI en modo de iones negativos y una cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC)/UPLC-MS/MS con ESI en modo de iones negativos. Estas cuatro metodologías se denominarán positiva temprana, positiva tardía, negativa y polar.

La primera alícuota se eluyó en gradiente de una columna C18 (Waters UPLC BEH C18-2,1 x 100 mm, 1,7 µm) utilizando agua y metanol, que contenía ácido perfluoropentanoico al 0,05 % y ácido fórmico al 0,1 %. Se analizó en condiciones ácidas positivas y se optimizó cromatográficamente para compuestos más hidrófilos (positivo temprano). La segunda alícuota se eluyó en gradiente de la misma columna C18 antes mencionada usando metanol, acetonitrilo, agua, ácido perfluoropentanoico al 0,05 % y ácido fórmico al 0,01 %. Se analizó utilizando condiciones ácidas positivas, pero cromatográficamente optimizadas para compuestos más hidrófobos (positivo tardío). La tercera alícuota se eluyó en gradiente de una columna C18 separada usando metanol y agua, con bicarbonato de amonio 6,5 mM a pH 8, y luego se analizó usando condiciones básicas negativas (negativas). La última alícuota se eluyó de una columna HILIC (Waters UPLC BEH Amide 2,1 x 150 mm, 1,7 µm) utilizando un gradiente que consistía en agua y acetonitrilo con formiato de amonio 10 mM a pH 10,8. Finalmente se analizó mediante ionización negativa (polar). El análisis de MS alternó entre escaneos de MS y MSn dependientes de datos mediante exclusión dinámica. El rango de escaneo varió entre los métodos, pero cubrió 70–1000 m/z.

Se analizaron varios tipos de controles junto con las muestras experimentales: una muestra de matriz combinada generada tomando un pequeño volumen de cada muestra experimental sirvió como réplica técnica en todo el conjunto de datos; las muestras de agua extraídas sirvieron como blancos de proceso; y se añadió a cada muestra analizada un conjunto de estándares de control de calidad cuidadosamente elegidos para no interferir con la medición de compuestos endógenos, para monitorear el rendimiento del instrumento y ayudar con la alineación cromatográfica.

Los datos brutos se extrajeron de las cuatro metodologías, obteniendo cuatro conjuntos de datos: positivos tempranos, positivos tardíos, negativos y polares. Se identificaron los picos, se procesó el control de calidad y se identificaron los compuestos comparándolos con entradas de biblioteca de estándares purificados o entidades desconocidas recurrentes. Las identificaciones se basaron en tres criterios: índice de retención, coincidencia de masa precisa con la biblioteca (+/- 10 ppm) y puntuaciones directas e inversas de MS/MS entre los datos experimentales y los estándares auténticos. Los picos se cuantificaron utilizando el área bajo la curva. La información sobre la función y las vías metabólicas de cada metabolito identificado provino de la base de datos del metaboloma humano y de la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto.

Se detectaron un total de 997 compuestos en el plasma de las dos líneas de conejos con las cuatro metodologías (252 positivo-temprano, 181 positivo-tardío, 448 negativos y 116 polares), de los cuales 852 eran entidades conocidas. El procesamiento de datos se realizó por separado para cada conjunto de datos.

Los metabolitos que no se detectaron (es decir, intensidad = 0) en una gran cantidad de muestras se eliminaron de los conjuntos de datos. Después de algunos análisis exploratorios, solo se mantuvieron los metabolitos que tenían menos del 10 % de ceros en al menos una línea, y los ceros restantes se imputaron utilizando un bosque aleatorio61. La cuantificación de los metabolitos en estudios de metabolómica no dirigida se refiere a cambios relativos62,63, es decir, como ocurre con los datos de composición, la información relevante está contenida en las proporciones entre las partes64. Por lo tanto, se aplicó una transformación aditiva de relación logarítmica65 (alr), que se define de la siguiente manera:

donde xj es la abundancia del j-ésimo metabolito, xref es la abundancia de un metabolito de referencia y J es el número total de metabolitos en el conjunto de datos. El metabolito de referencia se eligió siguiendo la metodología propuesta por Greenacre et al. (2021)23. Brevemente, esta metodología consistió en elegir el metabolito que (1) reprodujera la geometría del conjunto completo de proporciones logarítmicas en un análisis de Procrustes (medido por la correlación de Procrustes), y (2) tuviera una varianza baja, asegurando que la variación principal sea debido al numerador. Después del procesamiento de datos, los cuatro conjuntos de datos, correspondientes a las cuatro metodologías descritas anteriormente, se unieron y analizaron como se describe a continuación.

Las diferencias metabólicas entre líneas se identificaron mediante dos análisis separados. El primero fue un análisis discriminante de mínimos cuadrados parcial (PLS-DA), para el cual la variable dependiente era un vector categórico que codificaba la línea H o L. El segundo era un mínimo cuadrado parcial lineal (PLS), cuya variable dependiente era un vector que contenía el contenido del FMI. Ambos se realizaron utilizando el paquete R mdatools66 después de la estandarización del conjunto de datos (es decir, restar la media y dividir por la desviación estándar).

Se realizó una validación cruzada de modelos (CMV) para evitar el sobreajuste de los modelos PLS-DA y PLS67, y para seleccionar los metabolitos relevantes68. El CMV consta de una validación cruzada (CV) interna realizada para desarrollar y optimizar los modelos, y una CV externa para probar el rendimiento de los modelos67. Después de un análisis exploratorio, se utilizó un CV interno de 7 veces y un CV externo de 8 veces. Primero, las muestras se dividieron en 8 grupos de 6 muestras cada uno (CV externo de 8 veces) y un grupo se reservó como conjunto de prueba. Las muestras restantes (conjunto de entrenamiento) se sometieron a un procedimiento CV interno de 7 veces para desarrollar y optimizar el modelo. Luego, una vez desarrollado el modelo, se realizó un paso de selección de variables utilizando el valor de importancia de la variable en la proyección (VIP) y el intervalo de confianza de sus coeficientes de regresión (IC). Sólo se mantuvieron aquellos metabolitos que tenían un valor de VIP ≥ 0,8 y cuyo IC 95% no contenía el 0. Finalmente, se ajustó un nuevo modelo con los metabolitos seleccionados, y se utilizó para predecir la línea (en el caso de PLS-DA) o el contenido de IMF (en el caso de PLS) de las muestras previamente reservadas como conjunto de prueba. . Este procedimiento se repitió 8 veces, hasta que todos los grupos del CV exterior se reservaron una vez. Además, se realizaron 20 iteraciones de CMV, cambiando la composición de los grupos mencionados (Fig. 5).

Las muestras se dividieron en 8 grupos (CV externo de 8 veces). Un grupo de muestras se reservó como conjunto de prueba y las muestras restantes (conjunto de entrenamiento) se sometieron a un CV interno de 7 veces para desarrollar y optimizar el modelo. Una vez desarrollado el modelo, se realizó un paso de selección de variables y se ajustó un modelo final. El modelo final se utilizó para predecir la línea (en el caso de PLS-DA) o el contenido de FMI (en el caso de PLS) del grupo de muestras previamente apartadas. El procedimiento se repitió 8 veces (veces 1 a 8) hasta que todos los grupos estuvieron en el conjunto de prueba. Todo el procedimiento CMV se repitió 20 veces, cambiando la composición de las muestras de los conjuntos de prueba y entrenamiento del CV externo.

Después del CMV, se ajustaron un total de 160 modelos PLS-DA y 160 PLS para predecir cada conjunto de prueba (20 rondas de CV externo de 8 veces). Las predicciones obtenidas de los modelos PLS-DA se utilizaron para construir una tabla de clasificación errónea promedio para evaluar la capacidad de clasificación de los modelos, mientras que el parámetro Q2 se utilizó para evaluar la capacidad de predicción de los modelos PLS. Además, se realizó una prueba de permutación para analizar si el rendimiento de los modelos era mejor que el que se obtendría por casualidad. Para realizar la prueba se permutaron los valores de la variable dependiente (clases H y L para el PLS-DA o contenido IMF para el PLS) y se ajustaron nuevos modelos, realizando el mismo proceso CMV mencionado anteriormente. La tabla de clasificación errónea promedio se calculó para los modelos PLS-DA, mientras que para los modelos PLS se obtuvo el parámetro Q267.

Una vez ajustados y validados todos los modelos, los metabolitos considerados relevantes fueron aquellos que fueron seleccionados en más del 80% de los modelos (es decir, en más de 128 modelos PLS-DA o PLS, de forma independiente). Finalmente, solo se consideraron para análisis posteriores aquellos metabolitos seleccionados en ambos enfoques (PLS-DA y PLS).

El signo y la magnitud de las diferencias en la abundancia de metabolitos se estimaron como la diferencia fenotípica entre líneas. El modelo lineal aplicado fue

donde y es el vector de fenotipos, b es el vector de efectos fijos, incluidos los efectos de línea y sexo, e es el vector de varianzas residuales y X es la matriz de incidencia. Se aplicó la inferencia bayesiana69,70 mediante el programa Rabbit (Instituto de Ciencia y Tecnología Animal, UPV, Valencia, España). Se asumieron antecedentes planos acotados para todos los efectos fijos y varianzas. Se supuso que los efectos aleatorios residuales no estaban correlacionados y que a priori estaban distribuidos multinormalmente como: e ~ N (0, Iσ2e).

Las distribuciones marginales posteriores de las diferencias fenotípicas entre las líneas H y L se obtuvieron mediante muestreo de Gibbs. Los parámetros de las distribuciones posteriores tomados en consideración fueron la mediana de la diferencia (DH-L), el intervalo de densidad posterior más alto al 95% (HPD95%), y la probabilidad de que la diferencia sea mayor que cero cuando DH-L > 0. , o inferior a cero cuando DH-L < 0 (P0)70. Además, las diferencias entre líneas de cada metabolito se expresaron como unidades de su desviación estándar (DE).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen que subyacen a la figura 1 y la tabla 1 se proporcionan en los datos complementarios 1 a 4. Los datos de origen subyacentes a las Figs. 2b, 3 y 4 se proporcionan en los Datos complementarios 6. Otros conjuntos de datos analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Este estudio fue financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España, número de proyecto PID2020-115558GB-C21, y por la Conselleria de Innovación, Universidades, Ciencia y Sociedad Digital, número de proyecto AICO/2020/349. La tasa de acceso abierto fue financiada por la Universitat Politècnica de València.

Institute for Animal Science and Technology, Universidad Politécnica de Valencia, Valencia, Spain

Agustín Zubiri-Gaitán, Agustín Blasco y Pilar Hernández

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La conceptualización y el diseño experimental fueron realizados por AB y PH. Los datos fueron recopilados por PH y analizados por AZG. El manuscrito fue escrito por AZG y revisado por PH y AB. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Agostina Zubiri-Gaitán o Pilar Hernández.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Shaoming Fang y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Luke R. Grinham y George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Zubiri-Gaitán, A., Blasco, A. & Hernández, P. Perfil metabolómico plasmático en dos líneas de conejos seleccionadas de manera divergente por su contenido de grasa intramuscular. Común Biol 6, 893 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05266-3

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Recibido: 02 de marzo de 2023

Aceptado: 21 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05266-3

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