Descubrimiento y extracción optimizada del anti | Grupo API Veterinario de Sichuan

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11102 (2023) Citar este artículo

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La corteza de Ulmus macrocarpa Hance (UmHb) se ha utilizado durante mucho tiempo como medicina herbaria tradicional en el este de Asia para las enfermedades óseas. Para encontrar un disolvente adecuado, en este estudio comparamos la eficacia del extracto acuoso de UmHb y el extracto de etanol que pueden inhibir la diferenciación de osteoclastos. En comparación con dos extractos de etanol (70% y 100% respectivamente), los extractos hidrotermales de UmHb inhibieron más eficazmente los activadores del receptor de la diferenciación de osteoclastos inducida por el ligando del factor nuclear κB en macrófagos derivados de la médula ósea murina. Identificamos por primera vez que (2R,3R)-epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido (E7A) es un compuesto activo específico en extractos hidrotermales de UmHb mediante el uso de técnicas LC/MS, HPLC y NMR. Además, confirmamos mediante el ensayo TRAP, el ensayo de pozo y el ensayo de PCR que E7A es un compuesto clave en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos. La condición optimizada para obtener extracto de UmHb rico en E7A fue 100 ml/g, 90 °C, pH 5 y 97 min. En estas condiciones, el contenido de E7A fue de 26,05 ± 0,96 mg/g de extracto. Según el ensayo TRAP, el ensayo de pozos, la PCR y la transferencia Western, el extracto optimizado de UmHb rica en E7A demostró una mayor inhibición de la diferenciación de osteoclastos en comparación con el no optimizado. Estos resultados sugieren que E7A sería un buen candidato para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la osteoporosis.

El veinte por ciento de todos los huesos se reemplazan cada año mediante un equilibrio continuo entre la formación ósea por osteoblastos y la resorción ósea por osteoclastos1. Este proceso continuo llamado remodelación ósea puede mantener la forma, calidad y tamaño del esqueleto. A diferencia de la apariencia de una estructura mineralizada porosa, la remodelación ósea está diseñada para mantener el estado saludable del tejido óseo mediante la repetición de procesos de destrucción y resorción a través de un sistema metabólico activo continuo centrado en la interacción entre osteoclastos y osteoblastos. Los osteoclastos son células multinucleadas (MNC) derivadas de la diferenciación de linajes de monocitos-macrófagos que reabsorben los huesos mediante múltiples pasos. Cuando la resorción de los osteoclastos avanza más rápido que la producción ósea por parte de los osteoblastos, la densidad ósea y los componentes del propio hueso disminuyen, lo que conduce a enfermedades óseas2.

El género Ulmus de la familia Ulmaceae habita en regiones montañosas templadas y tropicales de los Estados Unidos, Eurasia y Medio Oriente, y ha florecido y se ha extendido por gran parte del hemisferio norte. Más de 40 especies de Ulmus se distribuyen en todo el mundo. Las especies representativas nativas de Corea incluyen Ulmus pumila L, Ulmus parvifolia Jacq, Ulmus davidiana Planchon, Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai y U. macrocarpa Hance. En particular, la corteza de Ulmus macrocarpa Hance (UmHb), también conocida como Yubaekpi, Yupi y Yugeunpi, es la cáscara de una planta que se consume en el este de Asia en forma de té como medicina herbaria después de secarla y molerla. Estas plantas también se llaman árboles de la nariz porque se sabe que mejoran la rinitis desde la antigüedad, cuando se consumían como té3.

Recientemente, se estudiaron extractos crudos de U. macrocarpa Hance para la modulación de la hiperlipidemia4, el tratamiento de la colitis ulcerosa5, los efectos anticoccidiales6, las propiedades antihipertensivas7 y el fotoenvejecimiento atenuado de la piel inducido por H2O2 y UVB8. La investigación sobre el tratamiento de enfermedades óseas utilizando árboles del otro género Ulmus se ha centrado generalmente en promover el crecimiento y la proliferación de los osteoblastos o inhibir la diferenciación de los osteoclastos. Estudios previos sobre otro género) demostraron que los extractos de U. davidiana Planch promovían la diferenciación de osteoblastos9, mientras que los flavonoides aislados de la corteza de Ulmus wallichiana estimulaban la función de los osteoblastos e inhibían la diferenciación de osteoclastos y adipocitos10. Se ha informado que la quercetina-6-C-β-D-glucopiranósido de U. wallichiana Planchon inhibe potentemente la formación de osteoclastos y mejora la pérdida ósea inducida por la ovariectomía en ratones11.

En un estudio previo, nuestro grupo encontró compuestos activos en el extracto etanólico de UmHb que inhiben la diferenciación de osteoclastos12. Dado que los asiáticos beben Yubaekpi como té caliente o como medicina herbaria, en el estudio actual investigamos la capacidad del extracto de agua caliente de UmHb para inhibir la diferenciación de osteoclastos. Un compuesto que no se encontró en extractos de etanol en estudios anteriores fue purificado e identificado mediante técnicas de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN). En este estudio, por primera vez, se aisló e identificó el compuesto activo del extracto acuoso caliente de UmHb como (2R,3R)-epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido (E7A). Hasta donde sabemos, este es también el primer informe de que el E7A extraído de UmHb con agua caliente inhibe la diferenciación de osteoclastos. Además, seleccionamos las especies de Ulmus de la corteza de las que se pudo extraer la mayor cantidad de E7A. Además, el método de extracción se optimizó mediante la metodología de superficie de respuesta (RSM) para obtener la mayor cantidad de E7A posible. Finalmente, demostramos que el extracto optimizado de UmHb inhibía la diferenciación de osteoclastos de manera dosis dependiente.

En este estudio, primero comparamos la capacidad del extracto de agua caliente para inhibir la diferenciación de osteoclastos con la de un extracto de etanol al 70% (o 100%). Se agregaron 300 mg de materia prima seca (UmHb) a 30 ml de agua destilada, etanol al 70 % o etanol al 100 % a 70 °C, seguido de extracción durante 120 min. Como se muestra en la Fig. 1A, los extractos de agua caliente inhibieron la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL de manera más eficiente que los extractos de etanol. El extracto 100 % acuoso redujo la cantidad de BMC TRAP positivas por pocillo en un 26,72 % en comparación con el vehículo, incluso a una concentración tan baja como 3 µg/ml. En las condiciones experimentales del estudio anterior, el extracto de etanol al 100 % mostró una reducción del 14,02 % a 3 µg/ml, y el extracto de etanol al 70 % se redujo en un 19,28 % a la misma dosis. Además, a la concentración de 10 µg/ml de extracto 100 % acuoso, el número de BMC TRAP positivas/pozo se redujo en un 53,53 %, lo que muestra un efecto inhibidor significativamente mayor sobre la diferenciación de osteoclastos en comparación con otros extractos a la misma dosis. Ninguno de los extractos de prueba evaluados por el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) mostró efectos citotóxicos significativos contra BMC a 1–20 μg / ml (Figura complementaria S1). Utilizamos LC-MS para encontrar compuestos de los tres extractos diferentes. Se encontró notoriamente un pico agudo (15,53 min) en el extracto hidrotermal, que rara vez se observó en los extractos de etanol al 70% y al 100% (Fig. 1B). Se utilizaron espectros de RMN 1H, RMN 13C, COSY, HSQC y HMBC para identificar y purificar el compuesto (Figuras complementarias 2 a 5).

(A) Efectos de los extractos de UmHb (1, 3 y 10 µg/ml) sobre la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL. Se contaron las multinacionales TRAP positivas (número nuclear> 3). (B) Comparación de cromatogramas LC-MS de extractos de UmHb (1 mg/ml) obtenidos con diferentes disolventes. Se observó un pico de alta intensidad en el extracto acuoso a los 15,53 min pero no en el extracto con etanol al 70% o al 100%. (C) Compuesto identificado E7A ((2R,3R)-epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido). Los datos son media ± DE (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 versus el vehículo (control positivo) según la prueba t de Student. Barra de escala, 500 μm.

El compuesto aislado del extracto hidrotermal de UmHb (Fig. 1C) estaba compuesto por una aglicona de flavan-3-ol y un resto de azúcar y mostró absorciones de UV a 203 nm (máximo) y 280 nm (máximo). Su fórmula molecular de C20H22O10 se redujo mediante picos de iones moleculares ESI MS positivos y negativos a m/z 423 [M + H]+ y 421 [M − H]-, respectivamente. El espectro de RMN 1H dio dos singletes aromáticos superpuestos en δ 6,13 para H-6 y H-8 de un anillo de benceno 1,2,3,5-tetrasustituido y tres señales aromáticas en δ 6,98, 6,80 y 6,76 de un sistema de espín ABX. La señal de protones de H-2 se observó como una señal singulete amplia en δ 4,82 en metanol-d4 y un doblete en δ 4,72 con una pequeña constante de acoplamiento de 3,5 Hz en DMSO-d6, que reveló una configuración relativa 2,3-cis. . La rotación óptica de −19,6 ([α]22D) sugirió una configuración absoluta 2R, 3R. Las cinco señales de protones alifáticos restantes se observaron en δ 5,49, 4,14, 4,09, 3,85 y 3,62, lo que sugirió la presencia de una D-apiofuranosa. El enlace del azúcar β se determinó basándose en la constante de acoplamiento (J = 2,9 Hz) del protón anomérico del resto apiofuranosa. El enlace 7-O del resto de azúcar en C-7 fue confirmado por las correlaciones HMBC de H-1'' con sus átomos de carbono vecinos C-6, C-7 y C-8. Este compuesto fue identificado como epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido (E7A).

Las BMC se cultivaron con RANKL 10 ng/ml y M-CSF 30 ng/ml durante tres días para generar preosteoclastos. Los preosteoclastos se diferenciaron en osteoclastos multinucleados maduros TRAP positivos (TRAP+MNC) mediante incubación con M-CSF (30 ng/ml) durante 30 minutos y RANKL (10 ng/ml) durante un día adicional12,13. Durante este paso de incubación se agregaron vehículos o compuestos aislados. Después de un día, los osteoclastos se fijaron y tiñeron utilizando un kit para calcular la actividad. El compuesto aislado del extracto en agua caliente se identificó como E7A. A continuación, se comparó la capacidad del compuesto recién descubierto E7A para reducir la diferenciación de osteoclastos con la del ulmosida A, que es el compuesto más eficaz en el extracto etanólico de UmHb, y con la de la catequina, que generalmente se considera el componente principal de corteza de árboles del género Ulmus. TRAP se utilizó como marcador primario debido a su alta expresión en osteoclastos activados. Como se muestra en la Fig. 2A, el ulmosido A y E7A mostraron una potente actividad inhibidora contra la diferenciación de BMC inducida por RANKL en osteoclastos maduros, mientras que las catequinas no tuvieron ningún efecto. Ulmoside A y E7A inhibieron la diferenciación de BMC inducida por RANKL en un 23,43% y un 47,13%, respectivamente, a 10 μM (Fig. 2A). El compuesto más potente, E7A, inhibió de forma dosis-dependiente la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL cuando se probó en concentraciones tan bajas como 1 μM (Fig. 2A). Los datos de IC50 de ulmosida A y E7A fueron 10,3 μM y 6,6 μM, como se muestra en la Fig. 2. Ninguno de los compuestos de prueba evaluados utilizando el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) mostró efectos citotóxicos significativos contra BMC a 20 μM. (Figura complementaria S6).

(A) Efectos de E7A (1, 10 y 20 µM) sobre la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL. Se utilizaron ulmosida A (UA) y catequina (CA) como controles positivos. (B) Se extrajeron varias cortezas del género Ulmus en las mismas condiciones y el contenido de E7A en los extractos se detectó en un tiempo de retención de 15,53 min mediante cromatografía LC-MS. Los datos son media ± DE (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 versus el vehículo (control positivo) según la prueba t de Student. Barra de escala, 500 μm.

Como se describió anteriormente, determinamos que el flavonoide glucósido E7A del extracto hidrotermal de UmHb inhibe la diferenciación de osteoclastos de manera más efectiva. Como siguiente paso, se llevó a cabo un experimento para investigar el contenido de E7A en las cortezas de diferentes especies de Ulmus que se mezclaban y vendían en el mercado. Estas cortezas se extrajeron en las mismas condiciones utilizando muestras secas pretratadas. Las muestras de solución extraídas se analizaron mediante LC/MS. Se detectó un pico de señal UV (210 nm) a los 15,53 min en todos los extractos excepto en el extracto de U. davidiana var japonica Nakai (Fig. 2B). Los experimentos de MS se realizaron en el pico a los 15,53 min para mejorar la precisión de los experimentos cualitativos (Figura complementaria S7). E7A, que seleccionamos como estándar y compuesto activo, dio picos en m/z 423 [M + H]+ y 421 [M − H]-. Los resultados de MS mostraron un pico a 423.150 m/z sólo en los extractos de U. pumila y UmHb. Utilizando el método de curva estándar de HPLC, se midió que el contenido de E7A (mg) por extracto (g) era 5,54 mg/g en el extracto de U. pumila y 17,28 mg/g en el extracto de UmHb, lo que muestra una diferencia de aproximadamente 3,12 veces. .

La inhibición de la expresión génica implicada en la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL por E7A se analizó mediante qPCR en tiempo real. Cuando las BMC activadas por RANKL se trataron con E7A 20 µM, la expresión de ARNm de NFATc1, TRAP, CTSK, OSCAR y DC-STAMP se suprimió significativamente desde los días 1 y 3 (Fig. 3A). Además de la qPCR en tiempo real de la expresión de ARNm de varios genes implicados en la diferenciación de osteoclastos, realizamos un ensayo de resorción para investigar el efecto de E7A en la función de resorción ósea de los osteoclastos maduros. La extensión de las fosas disminuyó de manera dependiente de la concentración de E7A en los BMC tratados con RANKL (Fig. 3B).

(A) Efecto de E7A sobre la expresión de ARNm de genes específicos de osteoclastos inducida por RANKL. Los niveles de expresión de ARNm de NFATc1, TRAP, DC-STAMP, OSCAR y catepsina K (CTSK) se midieron mediante qPCR en tiempo real. Se utilizó GAPDH como control interno. (B) Ensayo de fosa de resorción para osteoclastos. Se cultivaron BMC (6 x 104 células/pocillo) en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos en α-MEM que contenía M-CSF 30 ng/ml con o sin RANKL 10 ng/ml en ausencia o presencia de E7A (1, 3 , 10 o 20 μM) durante 4 d. El día 4, después de retirar el medio, se agregaron 100 µL de solución de lejía al 10%. La región de resorción se observó con un microscopio óptico (aumento de 100 ×) y se midió con el software Image J. Los datos son media ± DE (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al día 0 según la prueba t de Student. Barra de escala, 500 μm.

Se consideraron cuatro variables independientes (temperatura, pH, tiempo y proporción de disolventes) para determinar las mejores condiciones para la obtención del extracto de UmHb rico en E7A. Se utilizó RSM para analizar estadísticamente los efectos de la interacción de múltiples variables independientes en la respuesta14, y se utilizó la ecuación polinómica de segundo orden:

La Tabla 1 indica el análisis de varianza (ANOVA) de los modelos RSM para la respuesta. Los resultados mostraron que el modelo cuadrático fue significativo (P < 0,05) con una falta de ajuste no significativa (P > 0,05).

Los efectos de los parámetros de extracción sobre el contenido de E7A de los extractos de UmHb se representan en la Fig. 4 con un diagrama de superficie de respuesta tridimensional. Las condiciones de extracción óptimas para maximizar el contenido de E7A en el extracto de UmHb fueron 100 ml/g, 90 °C, pH 5 y 97 min. Se predijo que el rendimiento de E7A sería de 26,05 mg/g de extracto con un valor de deseabilidad de 0,856. Los experimentos por triplicado verificaron la condición prevista con el valor de 26,05 ± 0,96 mg de E7A/g de extracto.

Gráficos de superficie tridimensionales que muestran los efectos de la relación disolvente-sólido, la temperatura, el pH y el tiempo de extracción sobre el contenido de E7A en extractos de UmHb. (A) Se midió la cantidad de E7A con la relación y la temperatura como parámetros. (B) Relación y pH, (C) relación y tiempo, (D) temperatura y pH, (E) temperatura y tiempo, y (F) tiempo y pH como variables independientes.

Para investigar el efecto inhibidor del extracto de UmHb optimizado sobre la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL, las BMC se trataron con M-CSF y RANKL en ausencia o presencia del extracto. Se realizaron tinciones TRAP, qPCR en tiempo real, transferencia Western y ensayos de picaduras (Fig. 5). Según los resultados de la tinción TRAP, la diferenciación de osteoclastos se inhibió en proporción a la concentración del extracto, y la diferenciación en TRAP+MNC se redujo significativamente mediante el tratamiento con extracto. También se investigó la expresión de ARNm de genes relacionados con la diferenciación de osteoclastos. El tratamiento de BMC con 20 µg/ml de extracto redujo significativamente la expresión de ARNm de NFATc1, TRAP, DC-STAMP, CTSK y OSCAR (Fig. 5B). Además, el extracto redujo significativamente la expresión de la proteína NFATc1 (Fig. 5C), un regulador maestro de la diferenciación de osteoclastos15.

(A) La osteoclastogénesis mediada por RANKL fue suprimida por extractos de UmHb optimizados, que no tuvieron efectos citotóxicos. Se contaron las multinacionales TRAP positivas (número nuclear> 3) (n = 3). (B) Efectos del extracto de UmHb optimizado sobre la expresión de ARNm inducida por RANKL de genes específicos de osteoclastos. (C) Efecto del extracto de UmHb optimizado sobre la expresión proteica del factor de transcripción específico de osteoclastos NFATc1. (D) Ensayo de fosa de reabsorción para osteoclastos. Las BMC se sembraron en placas de cultivo de tejidos y se cultivaron en α-MEM que contenía M-CSF 30 ng/ml con o sin RANKL 10 ng/ml en ausencia o presencia de extractos de UmHb optimizados (1, 3, 10 o 20 μg/ml). ) durante 4 días. El día 4, después de retirar el medio, se agregaron 100 µL de solución de lejía al 10%. La región de resorción se observó con un microscopio óptico (aumento de 100 ×) y se midió con el software Image J. Los datos son media ± DE (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a los 0 días según la prueba t de Student. Barra de escala, 500 μm.

Anteriormente, publicamos que un extracto etanólico de UmHb exhibe actividad antiosteoclastogénica12. Como la UmHb se ha consumido tradicionalmente como té y se ha utilizado como medicina herbaria durante un período prolongado, planteamos la hipótesis de que también sería eficaz en extractos hidrotermales. Confirmamos su eficacia para inhibir la diferenciación de osteoclastos según las condiciones del disolvente de extracción. Como resultado, se investigó que el efecto de inhibir la diferenciación de osteoclastos fue mejor en los extractos hidrotermales y planteamos la hipótesis de que, a diferencia de los extractos de etanol, estarían presentes compuestos específicos en los extractos hidrotermales (Fig. 1A). Al comparar los datos de HPLC de los tres tipos de extractos, se encontró un pico (15,53 min) solo en los extractos hidrotermales, y se esperaba que la sustancia presente en esta ubicación tuviera el efecto de inhibición de la diferenciación de osteoclastos específico en los extractos hidrotermales (Fig. 1B).

Realizamos un experimento comparativo con E7A, un compuesto específico de extractos hidrotermales de UmHb y UA, el compuesto más eficaz en el extracto de etanol, y catequina, una estructura principal representativa del flavonoide de corteza de U. macrocarpa Hance. Como se muestra en los datos de los resultados, E7A mostró un rendimiento superior en comparación con otros compuestos, lo que representa una sustancia clave en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos (Fig. 2A). En conjunto, estos resultados indicaron que E7A inhibía eficazmente la función de resorción ósea y que la regulación de la expresión de NFATc1 es un mecanismo importante para esta acción de E7A. Además, la catequina (una estructura común de la columna vertebral) no fue eficaz para inhibir la diferenciación de osteoclastos. Pero el ulmosido A, una catequina unida a un glucósido, tiene efectos, aunque menos efectivos que el E7A. Significa que también se espera que los residuos de glucósidos desempeñen un papel muy importante en la eficacia.

Y comparando flavan-3-ol ((-) -epigalocatequina, (-) - galato de epigalocatequina y (-) - galato de epicatequina (EGC)), que es eficaz en la diferenciación de osteoclastos del té verde y E7A con relación estructura-función, El segundo y tercer carbono del flavan-3-ol tienen un punto común de configuración (R, R). Entre los flavonoides de los extractos de té verde, el EGC fue el más potente en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos, y la (-)-epigalocatequina y el galato de (-)-epigalocatequina tienen un efecto relativamente pequeño16. Si bien el enlace de carbono tiene una configuración (R, S), se confirmó que la catequina fue ineficaz en este estudio. Además, los estudios anteriores sugieren que la eficacia de la catequina-7-OD-apiofuranósido consiste en variantes de configuración (R, S), menos que E7A, que consta de estructuras de configuración (R, R)12.

E7A es una estructura que contiene epicatequina de estructuras de flavan-3-ol de configuración (R, R), que muestra una CI50 similar de efecto inhibidor al EGCG (6,6 mM), que tiene el mejor efecto de inhibición de la diferenciación de osteoclastos del té verde, lo cual es consistente con la lógica anterior17. Al enumerar los resultados anteriores, se puede confirmar que la estructura de unión de configuración (R, R) desempeña un papel clave en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos. Por lo tanto, se esperaba que el efecto inhibidor de la diferenciación de osteoclastos se viera afectado no sólo por la estructura principal de las catequinas sino también por la ubicación o el tipo de glucósidos adheridos adicionalmente.

En el ámbito de los estudios de productos naturales, a menudo se observa que especies dentro del mismo género comparten mecanismos biosintéticos similares. Teniendo esto en cuenta, investigamos si UmHb es la opción óptima para extraer E7A. Recolectamos cinco tipos del género Ulmus, que son nativos de Corea, y analizamos su contenido de E7A en las mismas condiciones de extracción. E7A se detectó en pequeñas cantidades en la mayoría de los árboles, encontrándose la concentración más alta en Ulmus macrocarpa Hance. Con base en estos resultados, llegamos a la conclusión provisional de que UmHb es el material más adecuado para lograr una alta pureza y una extracción eficiente de E7A. Es difícil concluir el efecto de inhibir la diferenciación de osteoclastos de E7A sólo con el ensayo TRAP, y esto se demostró mediante bioensayos con varios métodos. Se seleccionaron NFATc1, TRAP, DC-STAMP, OSCAR y CTSK como genes a confirmar. El metabolismo óseo se logra mediante un equilibrio complementario entre los osteoblastos que forman la matriz ósea y los osteoclastos que absorben el hueso18. Los osteoclastos se generan por proliferación, diferenciación, fusión y activación, comenzando con las células madre hematopoyéticas19,20. Las citoquinas factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y los activadores del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL) liberados por los osteoblastos desempeñan funciones esenciales en la diferenciación y generación de osteoclastos en las células madre hematopoyéticas21. En presencia de M-CSF, el mecanismo autocrino mediado por interleucina-1 permite que los osteoclastos interactúen con la matriz ósea22, lo que en última instancia conduce a un aumento del nivel de calcio en plasma. El RANKL liberado se une a su receptor RANK, que se expresa en la superficie de las células precursoras de osteoclastos mediante estimulación con M-CSF. Cuando las células precursoras de osteoclastos con su receptor de superficie (RANK) se unen a RANKL, estas citocinas activan señales importantes indicativas de la actividad de los osteoclastos mediante diversas proteínas adaptadoras y quinasas23,24.

En las primeras etapas de la señalización de RANK, RANKL se recluta en la cola citoplasmática de RANK a través de proteínas adaptadoras como TRAF6 (la principal proteína adaptadora responsable de mediar las cascadas de señalización que son activadas por RANKL)25, lo que conduce a la rápida activación de MAPK. NF-κB y proteína activadora-1 (AP-1)26. En el siguiente paso del proceso de señalización, el 1 citoplasmático (NFATc1), que es un factor nuclear de las células T activadas y un regulador clave de la osteoclastogénesis, se amplifica mediante la señalización orquestada de AP-1 activado y la oscilación de Ca2+ intracelular mediada por señal coestimuladora27 . Como paso final, el gen osteoclastogénico transcrito por NFATc1 sirve como mediador para regular la multinucleación y la absorción ósea en el núcleo24. En un estudio anterior, encontramos que los glucósidos flavonoides en el extracto de etanol de UmHb inhibían la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL y M-CSF en BMC a través de la expresión de NFATc112. NFATc1 es un factor de transcripción importante y regula la expresión de numerosos genes diana para la diferenciación de osteoclastos, incluidos TRAP, catepsina K (CTSK), receptor asociado a osteoclastos (OSCAR) y proteína transmembrana específica de células dendríticas (DC-STAMP)15. TRAP es una proteína altamente expresada en los osteoclastos que puede usarse como indicador de la formación de osteoclastos28. CTSK, que participa en la resorción ósea, es responsable de la degradación del colágeno tipo I durante la resorción ósea mediada por osteoclastos29. DC-STAMP y OSCAR participan en el proceso de multinucleación mediante la fusión célula-célula de osteoclastos mononucleares durante la diferenciación de osteoclastos30,31.

En la técnica de PCR, el resultado de que E7A inhibe la diferenciación de osteoclastos respecto al control se confirmó en NFATc1, TRAP, DC-STAMP, OSCAR y CTSK. Este resultado proporcionó una pista de que la diferenciación se suprimió no solo en el ensayo TRAP sino también en los niveles genéticos (Fig. 3A). Dado que estos factores también se utilizan como indicadores para confirmar la capacidad inhibidora de la diferenciación de osteoclastos en diversos experimentos in vivo, se puede esperar la posibilidad de obtener resultados positivos en experimentos con animales e in vitro. Los osteoclastos destruyen el tejido óseo, formando un agujero tridimensional en la superficie del hueso, llamado "foso de resorción" in vitro. Los estudios sobre osteoporosis han investigado el grado de absorción utilizando el tamaño y la profundidad del pozo de resorción32. Además, se confirmó que E7A tiene un efecto dependiente de la concentración al inhibir la diferenciación de osteoclastos incluso en el ensayo de fosa. En la diferenciación de osteoblastos, la actividad aumentó ligeramente cuando se trató BMP-2 (100 ng/ml) con E7A (Figura complementaria S10). Como resultado, E7A inhibe la diferenciación de los osteoclastos independientemente del mecanismo de los osteoblastos.

Para obtener el extracto rico en E7A más eficiente, el pH, la temperatura, la proporción y el tiempo se ordenaron como variables independientes. Entre las variables, se encontró que fueron significativos los efectos de la temperatura y el pH, así como la interacción entre ellos, con un coeficiente de determinación (R2) de 0,8513. Un aumento de temperatura conduce a un aumento del coeficiente de difusión y la solubilidad de los flavonoides, así como a un aumento significativo de la solvatación y la transferencia de masa33. Además, la temperatura elevada puede desencadenar la liberación de flavonoides de las plantas mediante la degradación de las estructuras celulares34. Se ha informado que las condiciones ácidas afectan la eficiencia de extracción de polifenoles como las antocianidinas 3-glucósidos35,36. Verificamos que el extracto optimizado rico en E7A de UmHb mostró la capacidad de inhibir la diferenciación de osteoclastos. Los extractos no tuvieron efecto citotóxico sobre las BMC en las concentraciones utilizadas en este experimento (1–20 µg/ml), lo que indica que la inhibición de la diferenciación de osteoclastos no se debió a la citotoxicidad del extracto (Fig. 5A). Los extractos optimizados mostraron un efecto significativo de inhibición de la diferenciación de osteoclastos tanto a nivel de proteína como de ARNm (Fig. 5B, C). El ensayo de resorción de la fosa reveló que el extracto redujo la extensión de la fosa de manera dependiente de la dosis (Fig. 5D). En conjunto, estos resultados sugieren que el extracto de UmHb optimizado reduce la diferenciación de osteoclastos y la función de resorción ósea de los osteoclastos maduros mediante la regulación negativa de la expresión de NFATc1. UmHb promueve la diferenciación de osteoblastos por BMP-2. Se puede observar que la actividad aumenta a una concentración de 20 µg/ml (Figura complementaria S10). Al comparar los valores de IC50 del extracto hidrotermal de UmHb (calculado a partir de los datos de la Fig. 1A) y el extracto hidrotermal optimizado (Fig. 5), la IC50 disminuyó de 3,57 a 3,17 µg/ml. Estos resultados indican que el efecto inhibidor de la diferenciación de osteoclastos se mejoró al aumentar el contenido del compuesto activo E7A a través de nuestro proceso de optimización (Figura complementaria S8). Estos extractos ricos en E7A muestran potencial como suplemento de mejora/tratamiento en enfermedades relacionadas con los huesos.

Este estudio investigó la eficacia de los extractos acuosos, ya que los humanos tradicionalmente han bebido té de UmHb como medicina herbaria durante muchos años. El extracto de agua caliente con UmHb fue más eficaz para inhibir la diferenciación de osteoclastos que el extracto de etanol. (2R,3R)-epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido (E7A) se identificó y purificó como una sustancia suficientemente presente en el extracto acuoso y rara vez se observó en extractos con etanol al 70 % y al 100 %. El glucósido flavonoide E7A inhibió significativamente la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL, y el efecto inhibidor fue mayor que el del ulmosido A, el compuesto más eficaz en el extracto etanólico de UmHb. Para mejorar la extracción de E7A, establecimos condiciones de extracción óptimas para UmHb utilizando RSM. Nuestros resultados indican que E7A y su extracto óptimo anulan la diferenciación de osteoclastos mediante la inhibición de la expresión de NFATc1, así como otros genes diana relacionados con la diferenciación de osteoclastos. Los hallazgos de nuestra investigación se han resumido en un diagrama de flujo, presentado en la Fig. 6. Estos resultados indican que E7A y su extracto óptimo tienen el potencial de desarrollarse como sustancias que pueden mejorar/prevenir la enfermedad de osteopenia. Se necesitan futuros estudios preclínicos y clínicos in vivo para investigar si el E7A y el extracto óptimo de UmHb inhiben la enfermedad de osteopenia y cuál es el mecanismo por el cual.

Resuma todo el estudio.

El espectro ultravioleta (UV) se obtuvo utilizando un espectrofotómetro UV Hitachi JP/U-3010 (Tokio, Japón). Todos los espectros de RMN se obtuvieron con un espectrómetro Bruker Ascend 700 (Billerica Middlesex County, MA, EE. UU.) utilizando MeOH-d4 (Gif-sur-Yvette, Francia) como disolvente. Los disolventes de RMN se adquirieron en el Laboratorio de Isótopos de Cambridge (Andover, MA, EE. UU.).

Los cambios químicos se obtuvieron haciendo referencia a cada pico de disolvente (HH 3,31 y CC 49,0 para metanol-d4). Los datos LC-MS de baja resolución se adquirieron con un HPLC Agilent Technologies serie 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) conectado a un espectrómetro de masas cuadrupolo Agilent Technologies 6130. Los datos de MS de alta resolución se registraron con un espectrómetro de masas de alta resolución Triple TOF 5600 (AB Sciex, Foster City, CA, EE. UU.) con un espectrómetro de masas cuadrupolo/TOF. Todos los datos de masa se obtuvieron con el método de ionización por pulverización de electrones (ESI).

La UmHb seca se compró a una empresa local (Jinsung FM). U. pumila L, U. parvifolia Jacq, U. davidiana Planchon y U. davidiana var. japonica (Rehder) Nakai fueron proporcionados por los Bosques de la Universidad Nacional de Seúl (SNUF), y sus identidades fueron confirmadas por uno de los coautores de este artículo, Ki Won Lee12. Este estudio cumple con la legislación pertinente y los lineamientos internacionales, nacionales e institucionales. El material vegetal se deshidrató en una cámara de secado bajo temperatura controlada de 50 °C, humedad relativa y velocidad del aire para asegurar la calidad del producto final. La corteza seca se cortó en trozos pequeños y se molió hasta obtener un polvo fino con una licuadora. Luego se recogió a mano y se redujo a un polvo fino (~ 20 mallas). Luego, las muestras en polvo se transfirieron a una bolsa con cremallera de polipropileno debidamente etiquetada y se mantuvieron a -80 °C durante un máximo de 30 semanas.

Se agregaron trescientos miligramos de muestras en polvo a 30 ml de agua destilada a 70 °C y se extrajeron durante 120 min después de ser suspendidas. La solución extraída se centrifugó a 3000 x g durante 1000 s a temperatura ambiente y el sobrenadante se filtró a través de papel de filtro Whatman No. 4.

El polvo de UmHb seco (50 g) se extrajo con agua desionizada a 70 °C durante 3 h. El extracto acuoso seco (312,5 mg) se resuspendió en agua destilada (250 ml) y la solución se fraccionó secuencialmente con diclorometano (250 ml), acetato de etilo (250 ml) y n-butanol (250 ml). La capa de n-butanol se sometió a cromatografía de exclusión molecular Sephadex LH-20 y se eluyó con metanol para obtener 46 fracciones (UMB1-UMB46). Las fracciones UMB13-46 contenían componentes químicos similares. Así, las fracciones UMB13-46 se combinaron y purificaron mediante RP-HPLC (Phenomenex Luna C18, 5 μm, 100 Å, 250 x 100 mm), eluyendo con MeOH al 35% y solo se aisló un compuesto (RT: 15,53 min; 13,5 mg). en el extracto acuoso.

(2R,3R)-epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido (E7A) polvo amorfo blanco y marrón; [α]20D -19,6 (c 0,52, MeOH); UV (MeOH) λ máx (log ε) 203, 278; RMN 1H (metanol-d4, 700 MHz) δ 6,98 (d,J = 1,7 Hz, H-2′), 6,80 (dd, J = 8,1, 1,7 Hz, H-6′), 6,76 (d,J = 8,1 Hz, H-5′), 6,14 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H6), 6,14 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H8), 4,82 (br s, H-2), 4,19 (m, H-3), 2,88 (dd, J = 16,8, 4,4 Hz, H-4a), 2,74 (dd, J = 16,8,2,6 Hz, H-4b), 2,88 (H-4a), 2,74 (H-4b) , 2,86 (H-4a), 2,54 (H-4b), 5,49 (d, J = 2,9 Hz, H-1″), 4,14 (d, J = 2,9 Hz, H-2″), 4,09 (m, H -4″a), 3,85 (d, J = 9,7 Hz, H4″b), 3,62 (m, H-5″), 5,49 (d, J = 2,9 Hz, H-1″); RMN 13C (metanol-d4, 175 MHz) δ 108,72 (C-1''), 79,94 (C-3''), 78,27 (C-2''), 75,40 (C-4''), 64,96 (C-5'') , 158,01 (C-7), (C-C1′), 119,36 (C-6′), 115,90 (C-5′), 115,28 (C-2′), 102,51 (C-10), 97,40 (C- 6), 97,17 (C-8), 80,29 (C-2), 67,29 (C-3), 29,27 (C4); ESI MS m/z 423 [M + H] +, 421 [M - H]-.

El extracto y los compuestos se analizaron utilizando un sistema HPLC Waters (Condado de Milford Worces, MA, EE. UU.) equipado con un detector de matriz de fotodiodos Waters 2998 en una columna HPLC Phenomenex Luna C18 (5 μm, 100 Å, 250 × 100 mm2). La temperatura de la columna se mantuvo a 24ºC. Los cromatogramas se procesaron a 210 nm y los espectros se obtuvieron entre 210 y 400 nm. Se utilizó un sistema de disolvente en gradiente que constaba de disolvente A (ácido fórmico acuoso al 0,1 % (v/v)) y disolvente B (ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo) a 1 ml/min según el siguiente procedimiento: 0–2 mín., del 2 al 25 % de B; 2 a 20 min, 50 a 95 % B. Se utilizaron disolventes de calidad HPLC (Daejeon, Corea) para el análisis de HPLC.

La diferenciación de osteoclastos y la tinción TRAP se realizaron como se informó anteriormente12,13. Aislamos células de la médula ósea (BMC) de acuerdo con el Protocolo estándar de investigación animal (SCNU) de la Universidad de Suncheon. El Protocolo de uso de animales fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Agencia de SCNU (Permiso No. SCNU IACUC 2021-05). Brevemente, se aislaron BMC lavando los fémures y las tibias de un ratón ICR de 5 semanas de edad con PBS20. Las BMC aisladas se cultivaron en α-MEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) con 10 ng/ml de M-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) durante 1 d. Las BMC obtenidas mediante la eliminación de restos celulares suspendidos en α-MEM se utilizaron para la diferenciación de osteoclastos. Se cultivaron BMC (1 x 104 células/pocillo) con M-CSF (30 ng/ml) y RANKL (10 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) durante 3 días para generar preosteoclastos. Los preosteoclastos se trataron con vehículo o con los compuestos indicados en presencia de M-CSF (30 ng/ml) durante 30 minutos y luego se cultivaron con RANKL (10 ng/ml) para su diferenciación en células multinucleadas maduras TRAP positivas (TRAP+- multinacionales). Después de un día, las células se fijaron con formaldehído al 3,7% durante 5 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 5 minutos y se tiñeron utilizando el kit de fosfatasa ácida de leucocitos 387-A (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. ). Se confirmó que todas las muestras de extracto utilizadas en el experimento se disolvieron completamente al máximo a una concentración de 10 mg/ml (Figura complementaria S9).

La viabilidad celular se evaluó controlando la conversión de la sal monosódica (WST) de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST) en formazán. según las instrucciones del fabricante (Dojindo, Kumamoto, Japón). Brevemente, se incubaron BMC separadas (1 x 104 células/pocillo) en placas de 96 pocillos durante 12 h en presencia de M-CSF (30 ng/ml) y luego se trataron con las concentraciones indicadas de dimetilsulfóxido (DMSO), extractos o compuestos flavonoides. Después de 3 días, se agregaron 10 μL de solución WST-8 a cada pocillo. La placa se incubó a 37 °C durante 4 h y luego se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Thermo, Varioskan Flash, Reino Unido).

La PCR en tiempo real se realizó como se describió anteriormente37. Las BMC se incubaron con M-CSF (30 ng/ml) en α-MEM de FBS al 10 % y se activaron con RANKL (10 ng/ml) durante 0, 1, 2 o 3 días en presencia de E7A o el extracto de UmHb optimizado. . Los conjuntos de cebadores de PCR (Tabla 2) se diseñaron utilizando el programa en línea Primer338. El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc M-MLV (Enzynomics, Daejeon, Corea). La PCR se realizó utilizando un TOPreal qPCR 2 × PreMIX (Bio-Rad, Hercules, CA) en un sistema de detección de PCR en tiempo real (Bio-Rad). Los niveles de ARNm de los genes se determinaron utilizando el método \(2^{{{-}\Delta \Delta C_{T} }}\). Se utilizó gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como estándar interno.

El análisis de transferencia Western se realizó como se describió anteriormente37. Brevemente, las BMC se incubaron con RANKL (10 ng/ml) y M-CSF (30 ng/ml) en FBS α-MEM al 10 % durante 0, 1, 2 o 3 días en presencia del extracto de UmHb optimizado. Las células recolectadas se lisaron con un tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasa y se cuantificaron utilizando el ensayo de Bradford. Las proteínas aisladas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS‒PAGE) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). La membrana se incubó con un anticuerpo primario (NFATc1) a 4 °C durante la noche. Se utilizó β-actina como control de carga.

Para analizar las actividades inhibidoras de E7A y el extracto optimizado de UmHb sobre la función de resorción ósea de los osteoclastos maduros, se analizó la superficie para la formación de fosas. Las BMC se sembraron en placas de 6 x 106 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se cultivaron con 30 ng/ml de M-CSF y 10 ng/ml de RANKL en presencia o ausencia de E7A o el extracto de UmHb optimizado durante 4 días. El día 4, después de retirar el medio, se agregaron 100 µL de solución de lejía al 10%. Después de una incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente, la placa se lavó dos veces con agua destilada y se secó a temperatura ambiente durante aproximadamente 4 h. Se observaron hoyos individuales o grupos de hoyos múltiples utilizando un microscopio con un aumento de 100 ×.

La línea celular de mioblastos de ratón, C2C12, se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE. UU.). Las células C2C12 se mantuvieron en FBS DMEM al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 2,5 x 103 células/pocillo. Después de 4 días, las células se diferenciaron reemplazando el medio con FBS DMEM al 10 % y BMP-2 (100 ng/ml) con E7A, el extracto de UmHb optimizado en la dosis indicada durante 4 días. La formación de hueso osteoblástico se observó mediante tinción con ALP.

La optimización de la extracción asistida por calor (HAE) se realizó en un calentador termostático utilizando un recipiente sellado para evitar la evaporación del disolvente. Las variables independientes empleadas para maximizar la concentración de E7A del extracto de UmHb fueron el tiempo de extracción (t, 60–120 min), la temperatura (T, 50–90 °C), el pH del solvente (pH, pH 5–13) y el sólido/ relación líquida (S/L, 60-100%). Las muestras de polvo seco se mezclaron con 30 ml de disolvente (agua destilada) y se procesaron bajo agitación electromagnética continua de acuerdo con el diseño experimental presentado en la Tabla 1. Después de la extracción, la mezcla se centrifugó (3000 x g durante 1000 s a temperatura ambiente) y el sobrenadante se filtró a través de papel de filtro Whatman No. 4. La concentración de E7A se calculó utilizando E7A purificado (pureza 95,47%, figura complementaria S10) en nuestro laboratorio como estándar, que no está disponible comercialmente en forma purificada.

Se aplicó el diseño Box-Behnken (BBD) con variables independientes [X1 (t, min), X2 (T, °C), X3 (pH) y X4 (S/L)] para optimizar la extracción de E7A de UmHb mediante AEH. Se eligió el BBD, que incluye 29 combinaciones independientes con 5 repeticiones en el centro del diseño experimental, para maximizar la capacidad predictiva del modelo (Tabla 1). La respuesta prevista (Y) se expresó como un modelo polinomial de segundo orden con cuatro variables independientes utilizando la siguiente ecuación:

Donde Xi y Xj representan las variables independientes, y β0, βi, βij y βii representan los coeficientes de regresión para los términos de intersección y lineal, cuadrático y de interacción, respectivamente.

Los resultados se representan como la media ± DE de tres réplicas. Las diferencias estadísticas se analizaron mediante la prueba t de Student. Los valores de probabilidad inferiores a 0,05 se consideraron significativos (valores de P * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y su archivo de información complementaria.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Coreano de Planificación y Evaluación de Tecnología en Alimentación, Agricultura y Silvicultura (IPET) a través del Programa de Desarrollo de Tecnología Alimentaria de Alto Valor Agregado, financiado por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Asuntos Rurales (MAFRA)(321029 -5), el Programa de Investigación en Ciencias Básicas financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (2019R1A2C2005492), el Programa Brain Korea 21 Plus del Departamento de Biotecnología Agrícola, la Universidad Nacional de Seúl, República de Corea y el Instituto Coreano de Promoción de Ciencias y Tecnología Marinas (KIMST), que está financiado por el Ministerio de Océanos y Pesca (20220488).

Estos autores contribuyeron por igual: Chanhyeok Jeong, Yeon-Jin Cho y Yongjin Lee.

Departamento de Biotecnología Agrícola e Instituto de Investigación de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea

Chanhyeok Jeong y Ki Won Lee

Instituto Bio-MAX, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea

Yeon-Jin Cho, Chang Hyung Lee, Jung Han Yoon Park, Heonjoong Kang y Ki Won Lee

Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Sunchon, 315 Maegok-dong, Suncheon, Jeollanam-do, 57922, Corea

Yongjin Lee y Young Jin Son

Laboratorio de Medicamentos Marinos, Facultad de Ciencias de la Tierra y del Medio Ambiente, Universidad Nacional de Seúl, NS-80, Seúl, 08826, Corea

Weihong Wang, Kyu-Hyung Park, Eun Roh y Heonjoong Kang

Instituto de Investigación de Oceanografía, Universidad Nacional de Seúl, NS-80, Seúl, 08826, Corea

Weihong Wang y Heonjoong Kang

Programa Interdisciplinario de Posgrado en Ingeniería Genética, Universidad Nacional de Seúl, NS-80, Seúl, 08826, Corea

Heon Joong Kang

Institutos Avanzados de Tecnología de Convergencia, Universidad Nacional de Seúl, Suwon, 16229, Corea

Ki Won Lee

Institutos de Biociencia y Tecnología Verdes, Universidad Nacional de Seúl, Pyeongchang, 25354, Corea

Ki Won Lee

Departamento de Biotecnología Agrícola y Centro para la convergencia biológica y alimentaria, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea

Ki Won Lee

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CHJ, YJC y YJL concibieron y diseñaron el concepto y escribieron el manuscrito principal. La preparación de los materiales y el extracto fue realizada por CHJ. La optimización de los estudios de extracción fue realizada por YJC. La diferenciación inhibidora de osteoclastos fue realizada por YJL y YJS. La espectroscopia de RMN 1H y los experimentos de HPLC fueron realizados por WHW y CHJKHP y ER participaron en experimentos de HPLC y análisis estadístico. La supervisión estuvo a cargo de CHL, YJHP, HJK y KWL.

Correspondencia a Ki Won Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Jeong, C., Cho, YJ., Lee, Y. et al. Descubrimiento y extracción optimizada del agente antiosteoclástico epicatequina-7-O-β-D-apiofuranósido de la corteza de Ulmus macrocarpa Hance. Representante científico 13, 11102 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38208-4

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Recibido: 20 de octubre de 2022

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 09 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38208-4

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